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Abstract
Contents
Introduction 11
1. Nucleosome 11
2. Histone variants 14
3. MacroH2A1 15
3.1. Structure of macroH2A1 15
3.2. Macrodomain 15
3.3. MacroH2A1 and X inactivation 17
3.4. Modification ofmacroH2A1 17
4. X inactivation 18
5. Genomic imprinting 19
6. Chromatin immunoprecipitation 20
7. Small interfering RNA (siRNA) 23
7.1. RNA interference (RNAi) pathway 23
7.2. Small interference RNA (siRNA) as a gene silencing tool 23
7.3. Cre-mediated conditional activation and inactivation of RNAi 25
8. Objective 29
Materials and methods 30
1. Materials 30
1.1. Mouse strains 30
1.2. Animal cell lines 30
1.3 Bacterial strains 30
1.4. Plasmids 30
1.5. Enzymes, antibody, kits and chemicals 31
1.6. Buffer and solutions 31
1.7. Oligonucleotides 32
2. Methods 40
2.1. Genomic DNA isolation 40
2.2. Genotyping for F2 heterozygotes 41
2.3. Chromatin immunoprecipitation 41
2.4. Polymerase Chain Reaction (PCR) 43
2.5. Quantitative real time PCR and data analysis for ChIP 45
2.6. Allele test 45
2.7. Vector construction 46
2.8. Isolation of plasmid DNA 46
2.9. Cell culture 48
2.10. Transfection 48
2.11. Establishing stable cell lines 49
2.12. Histone extraction 49
2.13. Western blot 50
2.14. Total RNA isolation 50
2.15. RT-PCR and quantitative real time PCR 51
2.16. Bisulfite treatment 52
2.17. Combined bisulfite restriction analysis(anaylsis) (COBRA) 52
2.18. Sequencing 54
Results 55
1. MacroH2A1 localization to the inactive Xist locus of male X chromosome 55
2. MacroH2A1 deposition in the methylated allele of Peg 3-DMR 60
3. Allele-specific deposition of macroH2A1 in other imprinting control regions (ICRs) 64
4. Relative ratios of macroH2A1 deposition(depositon) levels among different loci 72
5. MacroH2A1 knockdown stable cell lines 74
6. MacroH2A1 knockdown effects on the transcription of imprinted genes 76
7. MacroH2A1 knockdown effects on the DNA methylation of imprinted genes 79
Discussion 86
Conclusions 93
Summary 94
References 95
Acknowledgement 103
Curriculum vitae 105
Table 1. Restriction enzymes and the size of fragments for RFLPs 42
Table 2. Restriction enzymes and the size of fragments for COBRA 53
Figure 1. The structure of nucleosome 12
Figure 2. The structure of macroH2A1 16
Figure 3. The principle of genomic imprinting 21
Figure 4. Chromatin immunoprecipitation 22
Figure 5. Overview of RNAi pathway 24
Figure 6. The various strategies for RNAi in mammalian cells 26
Figure 7. Schematic representation of pSico and pSicoR before and after Cre-mediated recombination 27
Figure 8. Control experiments for ChIP and allele test 44
Figure 9. Comparison of purified genomic vs ChIP input DNAs 47
Figure 10. MacroH2A1 deposition on the male Xist locus 57
Figure 11. Schematic representation of macroH2A1 deposition patterns on X chromosome 58
Figure 12. MacroH2A1 deposition on theXist locus 59
Figure 13. MacroH2A1 deposition on the Peg3 imprinted domain 62
Figure 14. Quantitative PCR analysis of macroH2A1 deposition on Peg3 domain 63
Figure 15. Determination of the allelic origin of immunoprecipitated DNAs in Peg3 domain 65
Figure 16. MacroH2A1 deposition level at DMRs of H19/Igf2 imprinted domain 67
Figure 17. Allele-specific deposition of macroH2A1 at the imprinting control regions(ICR) 68
Figure 18. MacroH2AI deposition level at DMAs of Gtl2/Dlk1 imprinted DMR 70
Figure 19. Allele-specific deposition of macroH2A1 at the Gtl2/Dlk1 imprinting control regions 71
Figure 20. Relative ratios of macroH2A1 deposition among different loci 73
Figure 21. MacroH2A1 knockdown cell lines by siRNA 75
Figure 22. Chromatin immunoprecipitation analysis of macroH2A1 in macroH2A1 knockdown cell lines 77
Figure 23. Expression level changes of imprinted genes in macroH2A1 knockdown cell lines 80
Figure 24. Quantification of the expression level changes in macroH2A1 knockdown cell lines 81
Figure 25. DNA methylation levels of imprinted genes in macroH2A1 knockdown cell lines 85
초록보기 더보기
MacroH2A1는 histone H2A의 variant 중 하나로 유전자 전사를 억제하는 데 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 논문에서는, macroH2A1이 X 염색체와 상동염색체에 위치하고 있는 여러 유전자에 분포하고 있는 양상을 알아보았다. MacroH2A1는 promoter 근처의 메틸화된 CpG-rich 부위에 분포하고 있다. 여러 각인 유전자의 각인 현상 조절 부위에서의 macroH2A1의 분포 양상은 불활성화된 대립유전자의 메틸화된 위치에 특이적으로 분포되어 있다. 각인 유전자의 각인 조절부위와 차별 메틸화된 부위의 macroH2A1의 분포 정도는 암컷 포유류의 불활성 X 염색체에 분포하고 있는 정도보다 높거나 비슷했다. 이 결과는 DNA 메틸화 이외에 macroH2A1이 후유전적 유전자 발현 조절에 관여하는 구성요소라는 것을 나타낸다.
siRNA 기술을 이용하여 세포 내의 macroH2A1 단백질의 농도를 낮추어 macroH2A1이 유전자 각인현상에 어떤 영향을 주는 지 조사하였다. MacroH2A1 단백질의 농도가 낮은 Neuro2A 세포주에서 Peg3, Usp29, Nesp를 포함한 유전자의 발현이 낮아졌다. 이런 낮아진 유전자 발현은 DNA 메틸화 변화를 동반하지 않았다. 이는 macroH2A1이 대부분의 각인 유전자의 전사 주요한 억제자로써 역할을 하지 않을 수 있고 알려지지 않은 다른 기능을 가지고 heterochromatin 형성에 참여할 수 있다는 것을 의미한다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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