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Contents
I. Introduction 10
I-1. Fungus 10
I-1-1. Candidas 10
I-1-2. Aspergillus 12
I-2. Antifungal agents 14
I-2-1. Polyene antifungal agents 14
I-2-2. Azole antifungal agents 18
I-2-3. 5-Fluorocytosine 20
I-3. Liposomes 23
I-4. Commercial AmB formulation 26
II. Objectives 30
III. Experimental methods 31
III-1. Materials 31
III-2. Cells 32
III-3. Animals 34
III-4. Preparation of liposomal AmB 34
III-5. Size 36
III-6. Zeta potential 36
III-7. Loading efficiency 37
III-8. Morphology 37
III-9. Toxicity 38
III-9-1. MTT assay 38
III-9-2. Hemolysis 39
III-10. Antifungal activity 40
III-11. Pharmacokinetics 41
III-11-1. Plasma selection profiles of AmB in rat 41
III-11-2. Measurement of AmB concentration in plasma 42
III-11-3. Calculation of pharmacokinetic parameters 42
III-12. Survival rate 43
IV. Results and Discussion 44
IV-1. Screening of liposome 44
IV-1-1. Formulation of primary lipid 44
IV-1-2. Formulation of CHOL and DPPA 46
IV-1-3. Formulation of DSPE-mPEG2000 lipid 50
IV-2. Morphology 53
IV-3. Toxicity 53
IV-3-1. MTT assay 53
IV-3-2. Hemolysis 54
IV-4. Antifungal activity 57
IV-5. Pharmacokinetics 60
IV-6/IV-7. Survival rate 63
IV-6-1/IV-7-1. Survival rate of Aspergillus fumigatus infected mice 63
IV-6-2/IV-7-2. Survival rate of Candida albicans infected mice 64
V. Conclusion 69
VI. References 71
국문 요약 80
Table 1. The major antifungal agents and their common uses 21
Table 2. Characteristics of commercial AmB formulations [Hillery et. al., 2003] 27
Table 3. Effect of cholesterol contents in liposomal AmB on size and loading amount of AmB. Each point represents the mean ± S.D. (n=5) 47
Table 4. Comparison of MIC90 (㎍/ml) obtained with fumigatus albicans and Aspergillus fumigatus(이미지참조) 59
Table 5. Pharmacokinetic parameters for plasma AmB after I.V injection of liposomal AmBs, FungizoneR and AmBisomeR at a dose of 2.0 mg/kg to rats(이미지참조) 62
Figure 1. Schematic illustration of fungal cell infected through the respiratory organs. 11
Figure 2. Chemical structure of polyene antifungal agents. 16
Figure 3. Schematic model for polar porous of AmB channel. 17
Figure 4. Chemical structure of (a) Ketoconazole, (b) Itraconazole and (c) 5-fluorocytosine. 19
Figure 5. Generalized fungal cell depicting the sites of action of the common antifungal agents. 22
Figure 6. Structure of (a) liposome and (b) lipid bilayer. 24
Figure 7. Illustration of (a) 293 cells, (b) Candida albicans fungal cell, (c) Aspergillus fungal cells. 33
Figure 8. Possible mechanism of liposome formation by the modified SESE method. 35
Figure 9. Effect of alkyl chain length in liposomal AmB on size and lipid transition temperature. Each point represents the mean ± S.D.(n=5) 45
Figure 10. Effect of DPPA contents in liposomal AmB on size, zeta potential and loading amount of AmB. 48
Figure 11. Effect of DSPE-mPEG2000 contents in liposomal AmB(DPPC:CHOL:DPPA=8:4:2 mal. ratio) on size and loaded AmB. Each point represents the mean ± S.D. (n=5). 51
Figure 12. Structure of liposomal AmB at cryo-TEM and schematic description of the intercalated AmB between lipid bilayers of liposomes. 52
Figure 13. Cytotoxicity of liposomal AmB, FungizoneR and AmBisomeR in 293 cells (human kidney cells) as measured by MTT test after 4 hrs incubation at 37 ℃....(이미지참조) 55
Figure 14. Hemolysis of FungizoneR and liposomal AmBs toward rat's erythrocytess (below 37℃). Each point represents the mean value ± S.D. (n=3).(이미지참조) 56
Figure 15. Plasma concentration of AmB after I.V. injection of liposomal AmBs, FungizoneR and AmBisomeR at a dose of 2.0 mg/kg to rats.(이미지참조) 61
Figure 16. Survival rate of mice infected with Aspergillus fumigatus treated with liposomal AmBs, FungizoneR and AmBisomeR at a dose of 3.0 mg/kg....(이미지참조) 67
Figure 17. Survival rate of mice infected with Candida albicans treated with liposomal AmBs, FungizoneR and AmBisomeR at a dose of 3.0 mg/kg....(이미지참조) 68
초록보기 더보기
전신성 호흡기 진균은 정상인에게서도 80% 이상의 높은 보균률을 나타내지만 면역작용에 의해 질병으로 발현되지 않는다. 그러나 화학치료나 후천성 면역결핍증(Aquired Immune Deficiency Syndrome; AIDS)로 인해 면역력이 약화된 환자의 경우, 생명을 위협하는 가장 치명적인 질병으로 발현할 수 있다. 이때 치료의 목적으로 사용되는 대표적인 폴리엔계 항진균제인 암포테리신 B는 균류의 막 스테롤인 에르고스테롤과 강하게 결합함으로써 광범위적인 치료효과를 나타낸다. 암포테리신 B는 1950년대 개발되었음에도 불구하고 용해도가 낮고 높은 독성과 낮은 치료효과로 인해 그 사용이 제한적이었었다. 최근에는 에멀젼, 나노파티클, 리포솜 등을 이용한 나노 크기의 제제화를 통해 이를 극복하려는 노력이 활발히 진행되고 있으나 아직까지 만족할만한 결과를 얻지 못하고 있다. 본 실험에서는 PEG와 음이온성 인지질로 개질된 서방형 리포솜을 사용하여 암포테리신 B의 봉입율과 치료효과 및 체내 순환시간을 향상시키고 부작용을 감소시켰으며, 제형의 입자크기, 약물 봉입율 및 표면전하의 변화에 대한 평가와 함께 세포시험과 동물실험을 통하여 확인하였다.
리포솜의 제조에 사용된 인지질은 체내 구성 성분으로써 높은 생체 친화성과 생분해성으로 인해 제형으로 인한 부작용이 없다는 장점을 갖고 있다. 암포테리신 B-리포솜의 제조는 암포테리신 B와 DPPC, DPPA, Cholesterol 및 DSPE-mPEG2000를 8:4:2:0.3의 몰비로 유기용매에 용해하고 초음파분쇄기를 사용하여 수상에 분산시킴으로써 나노 크기의 리포솜으로 제조하였다. 제조된 암포테리신 B-리포솜은 90% 이상의 봉입효율과 100nm 전후의 입자 크기, 높은 상전이 온도를 갖고 있어 체내에서 제형의 안정성 향상을 통한 체내 순환시간이 증가되었다. 특히, 음이온성인 인지질과 암포테리신 B의 강한 이온 결합력을 유도하여 보다 높은 봉입율을 획득할 수 있었다. 신장 세포와 진균세포에 대한 독성 실험을 통하여 정상세포에 대한 부작용이 낮음에도 불구하고 항진균성은 감소되지 않았다. 렛(rat)을 이용한 약동학적인 실험에서는 DSPE-mPEG2000으로 표면 개질된 리포솜이 가장 긴 체류 시간을 갖고 있어 암포테리신 B의 서방형 제형으로써 적합함을 확인하였다. 한편, candida albicans와 aspergillus fumigatus로 전신 감염된 마우스(mouse)를 리포솜형-암포테리신 B로 치료한 결과 80% 이상의 생존율을 나타내었다. 리포솜형-암포테리신 B는 기존의 암포테리신 B 제형인 펀지존® 및 암비솜®에 비하여 동등 혹은 그 이상의 치료효과와 정상세포에 대한 낮은 부작용을 갖고 있어 전신성 호흡기 진균증으로 고통 받는 환자들의 치료에 보다 효과적인 제형으로 기대된다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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