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국문요약
목차
Ⅰ. 서 론 16
Ⅱ.재료 및 방법 27
1. 시료의 채집 27
2. 배지 및 배양조건 27
3. 실험균주 27
3. 1. 탄저병균의 분리 27
3. 1. 1. 탄저병균의 배양 및 형태적 특징 조사 28
3. 1. 2. 분리된 탄저병균의 병원성 검정 28
3. 2. Bacillus spp.의 순수 분리 29
4. 항진균의 선발 29
4. 1. 사용 균주 29
4. 2. 균사의 생장억제 29
4. 3. 포자 발아 억제 30
5. 항진균 Bacillus spp.의 종 동정 30
5. 1. 생리·생화학적 특성 분석을 통한 동정 30
5. 2. Biolog kit에 의한 방법 31
6. 항진균 선발을 위한 배양 조건 탐색 31
7. B. amyloliquefaciens IUB158-03에 대한 최적 배지 조건 32
7. 1. 탄소원의 영향 32
7. 2. 질소원의 영향 32
7. 3. 인산염의 영향 32
7. 4. 초기 pH의 영향 32
7. 5. 최적 배양 온도와 시간 33
8. 항진균물질의 분리 및 정제 33
8. 1. 항진균 물질의 조추출 33
8. 2. Silica gel column chromatography 35
8. 3. Thin layer chromatography (TLC) 35
8. 4. Preparative TLC 35
8. 5. High performance liquid chromatography (HPLC) 37
8. 6. TLC로 단일 물질 확인 37
9. 항진균물질의 특성 분석 37
9. 1. 유기용매에 대한 용해성 37
9. 2. pH에 대한 안정성 38
9. 3. 온도에 대한 안정성 38
9. 4. 병원미생물에 대한 활성 범위 38
10. 항진균물질의 성분 분석 39
10. 1. TLC를 이용한 항진균물질 성분 확인 39
10. 2. UV spectroscopy 39
10. 3. FAB-mass spectroscopy 40
10. 4. 아미노산 조성 분석 40
11. 항진균물질의 활성 검정 40
11. 1. 시판 농약의 항진균물질의 활성 비교 40
11. 1. 1. C. gloeosporioides의 균사 생장 억제 40
11. 1. 2. C. gloeosporioides의 포자 발아 억제 41
11. 2. 항진균물질의 길항력 검경 41
11. 3. Scanning Electron Microscopy (SEM) 42
11. 4. 고추종자에 대한 병원성과 항진균물질의 활성 42
11. 5. 고추열매에 대한 병원성과 항진균물질의 활성 43
12. 항진균물질의 독성 실험 43
12. 1. 세포주 배양 43
12. 1. 1. 세포독성 실험 43
12. 2. 동물 실험 45
12. 2. 1. 실험 동물의 사육 45
12. 2. 2. 실험 동물 경구투여 45
12. 2. 3. 부검 및 체중 측정 46
12. 2. 4. 혈 중 백혈구 수에 미치는 영향 46
12. 2. 5. 혈액 생화학적 검사 46
Ⅲ. 결과 및 고찰 47
1. 고추 탄저병균의 분리 및 동정 47
1. 1. 분리된 탄저병균의 병원성 검정 48
2. Bacillus spp.의 분리 52
2. 1. Bacillus spp. 균주의 항진균 선발 52
2. 1. 1. 균사 생장 억제 52
2. 1. 2. 포자 발아억제 53
3. 항진균 Bacillus spp.의 종 동정 53
4. 항진균 선발을 위한 배양조건 탐색 55
5. B. amyloliquefaciens IUB158-03의 항진균물질 생산을 위한 최적 배지 조건 60
5. 1. 탄소원의 영향 60
5. 2. 질소원의 영향 68
5. 3. 인산염의 영향 68
5. 4. 초기 pH의 영향 72
5. 5. 최적 배양 온도와 시간 72
6. 항진균물질의 정제 74
6. 1. 항진균물질의 조추출 74
6. 2. 항진균물질의 분리 및 정제 74
6. 2. 1 Silica gel column chromatography 74
6. 2. 2. Preparative TLC 78
6. 2. 3. HPLC 79
6. 2. 4. TLC를 이용한 항진균물질의 단일 물질 확인 79
7. 항진균물질의 특성 분석 83
7. 1. 유기용매에 대한 용해성 83
7. 2. pH에 대한 안정성 83
7. 3. 온도에 대한 안정성 84
7. 4. 병원미생물에 대한 활성 범위 84
8. 항진균물질의 성분 분석 86
8. 1. TLC를 이용한 항진균물질 성분 확인 86
8. 2. UV spectroscopy 86
8. 3. FAB-mass spectrum 90
8. 4. 아미노산 분석 90
9. 항진균물질의 활성 검정 93
9. 1. 항진균물질의 활성도 비교 93
9. 2. 시판 농약과 항진균물질의 활성 비교 93
9. 2. 1. C. gloeosporioides의 균사 억제 93
9. 2. 2. C. gloeosporioides의 포자발아 억제 95
9. 3. 항진균물질의 길항력 검경 98
9. 3. 1. 포자 발아 억제 현미경 관찰 98
9. 3. 2. Scanning Electron Microscopy (SEM) 98
9. 4. 고추종자에 대한 병원성과 항진균물질의 활성 100
9. 5. 고추열매에 대한 병원성과 항진균물질의 활성 103
10. 항진균물질의 독성 실험 103
10. 1. 세포독성 105
10. 2. 동물 독성 실험 105
10. 2. 1. 부검 및 체중 측정 105
10. 2. 2. 백혈구 수에 미치는 영향 105
10. 2. 3. 혈액 생화학적 검사 109
Ⅳ. Appendix 113
Ⅴ. Reference 121
Abstract 141
감사의 글 143
Figure 1. Extraction procedure of crude antifungal substances produced
by B. amyloliquefaciens IUB158-03 34
Figure 2. Procedure of purification of antifungal substances produced
by B. amyloliquefaciens IUB158-03 36
Figure 3. Mycelia (A) and conidial (B) morphology of C. gloeosporioides isolated from diseased red pepper fruit.
Mycelia was formed on a PDA plate and conidia was observed under
a microscope with the magnification of 400? 50
Figure 4. Antifungal activity of Bacillus spp. against spore germination
of C. gloeosporioides 54
Figure 5. Growth profile and time course analysis of antifungal activity
production of B. licheniformis IUB066-22 in LB medium 61
Figure 6. Growth profile and time course analysis of antifungal activity
productions of B. amyloliquefaciens IUB158-03 in LB medium 62
Figure 7. Growth profile and time course analysis of antifungal activity
production of Paenibacillus pabuli IUB225-08 in LB medium 63
Figure 8. Growth profile and time course analysis of antifungal activity
production of B. megaterium IUB225-12 in LB medium 64
Figure 9. Growth and antifungal activity of B. amyloliquefaciens IUB158-03
cultured in the medium containing various carbon sources (1%) 66
Figure 10. Growth and antifungal activity of B. amyloliquefaciens IUB158-03 in the medium containing various concentrations of soluble
starch and raffinose. Control was grown in LB medium 67
Figure 11. Growth and antifungal activity of B. amyloliquefaciens IUB158-03 in the medium containing various nitrogen sources (1%). Control was consisted of 2% soluble starch, 0.5% yeast extract, 1% tryptone, and
1% NaCl 69
Figure 12. Growth and antifungal activity of B. amyloliquefaciens IUB158-03 in the medium containing various concentrations of yeast extract and tryptone 70
Figure 13. Growth and antifungal activity of B. amyloliquefaciens IUB158-03 in the medium containing various phosphorus sources (0.5%) Control was consisted of 2% soluble starch, 3% yeast extract, 1% tryptone
and 1% NaCl 71
Figure 14. Effect of initial pH on the growth and production of antifungal activity by B. amyloliquefaciens IUB158-03 under optimal conditions 73
Figure 15. Effect of temperature and time courses on the growth and production of antifungal substances from B. amyloliquefaciens IUB158-03
in the optimized medium 75
Figure 16. Phase contrast photomicrographs of B.amyloliquefaciens IUB158-0
3 during the growth in the optimized medium 76
Figure 17. HPLC chromatogram of the antifungal substances purified from
B. amyloliquefaciens IUB158-03 80
Figure 18. TLC resolution of the antifungal substance purified from the crude
extract of B. amyloliquefaciens IUB153-03 dissolved in various solvent systems 82
Figure 19. TLC of the active fraction of the antifungal substance purified from the crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03. TLC plates were developed by spraying with ninhydrin and heated at 1
10℃ 88
Figure 20. UV absorption spectrum of antifungal substance purified from the culture extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03 89
Figure 21. Positive ion FAB-mass spectrum of the antifungal substance
purified from the crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03 91
Figure 22. Inhibition zone of C. gloeosporioides spores by the antifungal substance purified from the crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03 A; Culture filtrates of B. amyloliquefaciens IUB158-03 under optimal culture conditions (100 ㎍/㎖) 94
Figure 23. Comparison of mycelial growth and spore germination of C. gloeosporioides treated with the crude extract containing the agricultural chemicals mycelial growth on PDA containing each fungicide (10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖) were 97
Figure 24. Microscopy of spore germination of C. gloeosporioides treated with the antifungal substance purified from the crude extract of B.
myloliquefaciens IUB158-03 99
Figure 25. Scanning electron microscopy of mycelial treated for 3 and 7 days at 25℃ with the antifungal substances purified from the crude extract
of B. amyloliquefaciens IUB158-03 101
Figure 26. Seed germination and seedling rot of pepper plants inoculated with the antifungal substance purified from the crude extract of B.
myloliquefaciens IUB158-03 102
Figure 27. Effect of antifungal activity against C. gloeosporioides treated with antifungal substance purified from the crude extract of B. amyloliquefaciens I
UB158-03 104
Figure 28. In vitro cytotoxicitya of the crude extract of B. amyloliquefaciens
IUB158-03 against the NIH3T3b 106
Figure 29. Autopsy of ICR mice treated with the crude extract of
B. amyloliquefaciens IUB158-03 108
Table 1. Mechanism of fungicide resistance 25
Table 2. Cultural characteristics of the three groups of C. gloeosporioides
from diseased red pepper fruits 49
Table 3. Pathogenicity of C. gloeosporioides against to green and red
pepper fruits 51
Table 4. The morphological, physiological and biochemical characteristics
of the isolated Bacillus spp 56
Table 5. The reaction of B. amyloliquefaciens IUB158-03 to 95 carbon
sources of the 96-well microplate (Biolog GP2 Microplate) 57
Table 6. Identification of Bacillus strains used in this study 59
Table 7. The optimal culture conditions for the production of
antifungal substances from B. amyloliqeufaciancy IUB158-03 77
Table 8. Rf values of the antifungal substance purified from the crude extract
of B. amyloliquefaciens IUB158-03 dissolved in various solvent system 81
Table 9. Antimicrobial spectrum of the antifungal substance purified from the crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03 against various
pathogenic microorganisms 85
Table 10. Color reactions of the antifungal substance purified from the
crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03 87
Table 11. Amino acid composition of the antifungal substance purified
from B. amyloliquefaciens IUB158-03 92
Table 12. Lipopheptapeptide antibiotics of Bacillus spp 146
Table 13. Antifungal activity of agricultural chemicals and the crude extract produced from B. amyloliquefaciens IUB158-03 against mycelial
growth and spore germination of C. gloeosporioides 96
Table 14. Body weights of ICR mice treated with the crude extract of
B. amyloliquefaciens IUB158-03 107
Table 15. Effect of the crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03
on the number of circulating leukocytes in ICR mice 110
Table 16. Hematobiological analysis in ICR mice administered the
crude extract of B. amyloliquefaciens IUB158-03 112
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