표제지
목차
요약문 4
1. 연구개발과제의 개요 6
가. 간암 질환의 개요 6
나. 간암 치료제 개발 현황 7
다. "한국형 간암 3차원 종양 환경" 특이 대사 조절을 통한 항암치료제 개발 전략 8
라. 간암 치료제 개발을 위한 표적으로서의 물질 대상 인자 발굴 전략 9
마. 간암 치료제 개발을 위한 물질대사 이상 관련 표적 발굴의 필요성 9
2. 연구수행내용 및 성과 10
가. 한국인 간암 특이적인 대사 조절 인자를 발굴 10
나. 발굴된 간암 특이적 대사 인자의 기능 연구 13
다. 발굴된 간암 특이적 대사 인자 기반의 대용량 스크리닝 플랫폼 제시 및 유효 물질 도출 22
라. 후보약물의 in vitro 및 in vivo 효능 검증 28
3. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 34
가. 목표 34
나. 목표 달성여부 34
다. 목표 미달성 시 원인(사유) 및 차후대책(후속연구의 필요성 등) 36
4. 연구개발성과의 활용 계획 등 36
[붙임] 참고문헌 37
[표 1] TCGA 기반 SORD발현에 따른 간암환자 생존률 분석 11
[표 2] TCGA 기반 ASS1 발현에 따른 간암환자 생존률 분석 11
[표 3] TCGA 기반 GRP78 발현에 따른 간암환자 생존률 분석 11
[표 4] ASS1 과발현된 3D 간암 구상체에서 특이적으로 up-regulation되는 유전자 17
[표 5] ASS1 과발현된 3D 간암 구상체에서 특이적으로 down-regulation되는 유전자 17
[표 6] ASS1 과발현된 2D와 3D 비교시 3D 간암 구상체에서 up-regulation되는 유전자 17
[표 7] ASS1 과발현된 2D와 3D 비교시 3D 간암구상체에서 down-regulation되는 유전자 18
[표 8] ASS1 스크리닝을 통해 도출된 약물리스트 23
[표 9] GRP78 스크리닝을 통해 도출된 약물 리스트 27
[그림 1] 2016년 HCC로 새롭게 진단된 환자 수 6
[그림 2] Top targets for drug discovery against HCC 6
[그림 3] Hepatocellular Carcinoma SWOT Analysis 7
[그림 4]/[그림 3] (A) 전 세계적 간암치료제 시장규모, (B) 글로벌 제약사의 면역항암제 시장 규모 8
[그림 5]/[그림 4] 한국형 간암 특이 대사 조절을 통한 항암 치료제 개발 전략 8
[그림 6]/[그림 5] 간암 신약표적으로서 대사인자의 발굴을 위한 파이프라인 9
[그림 7]/[그림 6] 간암환자 유래세포를 이용한 다세포성 종양 구상체에서의 약물 민감성 비교 10
[그림 8]/[그림 7] 3차원 간암 구상체 유래 대사인자 발굴 10
[그림 9]/[그림 8] 한국형 간암 특이적인 대사 조절 인자를 발굴하기 위한 TCGA 기반 생물정보학적 분석 전략 11
[그림 10]/[그림 9] SORD의 발현량과 환자생존율과 상관관계 분석 12
[그림 11]/[그림 10] ASS1의 발현량과 환자 생존율과의 상관관계 분석 12
[그림 12]/[그림 11] 간암환자의 정상 및 간암 조직으로부터 발현되는 ASS1 12
[그림 13]/[그림 12] GRP78의 발현량과 환자 생존률과의 상관관계 분석 12
[그림 14]/[그림 13] 환자 유래 간암세포(A), 정상 간세포주 및 간암 세포주(B), 인종(C)에 따른 ASS1 발현량 13
[그림 15]/[그림 14] ASS1의 과발현에 따른 세포증식(A), 세포이동(B), 상피중간엽전이 관련 인자 변화(C) 13
[그림 16]/[그림 15] ASS1 발현량에 따른 시스플라틴 약물 감수성 확인 13
[그림 17]/[그림 16] 간암환자 유래 간암세포에 대한 cisplatin의 반응성과 ASS1의 발현양 14
[그림 18]/[그림 17] ASS1 과발현에 의한 악성간암종 세포주인 Huh7 (A)과 SNU475 (B)에서의 약물민감성 14
[그림 19]/[그림 18] 간암 종양 미세환경에서의 소포체 스트레스 조절자로서 ASS1 15
[그림 20]/[그림 19] ASS1 발현에 의한 해당과정 효소 발현 변화 15
[그림 21]/[그림 20] 해당과정 저해제인 2-DG에 의한 ASS1의 발현 변화 15
[그림 22]/[그림 21] ASS1 변화에 의한 해당과제 저해제인 2-DG에 대한 악성 간암종 약물민감성 16
[그림 23]/[그림 22] ASS1 과발현에 의한 유전자 변화 hit-map과 후보물질간의 관련성 16
[그림 24]/[그림 23] 과발현된 ASS1과 상호 연관관계에 있는 유전자 관계도 18
[그림 25]/[그림 24] ASS1의 발현을 유도한 3차원 간암 구상체의 RNA sequence 결과와 Q-PCR 결과의 비교 분석 A. up-regulation 그룹, B. down-regulation 그룹, C. no match 그룹 18
[그림 26]/[그림 25] 간암세포주에서 후보 인자 X와 ASS1의 발현 비교 19
[그림 27]/[그림 26] 환자 유래 간암세포 구상체에서의 mRNA 발현량(A), 정상간세포주 및 한국인 간암세포주(B), 서양인 간암세포주(C)에 따른 SORD 단백질의 발현량 19
[그림 28]/[그림 27] 재조합 SORD 단백질 처리에 따른 세포 사멸(A-B) 및 세포 증식 변화(C) 19
[그림 29]/[그림 28] SORD 단백질과 glycolysis 관련 단백질들과의 연관성 20
[그림 30]/[그림 29] 재조합 SORD 처리에 따른 glycolysis 관련 단백질 발현 변화 20
[그림 31]/[그림 30] 재조합 SORD 처리에 따른 monocyte의 성장(A-B) 및 M1 macrophage 분화(C) 변화 20
[그림 32]/[그림 31] 환자 유래 간암세포 구상체에서의 mRNA 발현량(A), 정상간세포주 및 한국인 간암세포주(B), 서양인 간암세포주(C)에 따른 GRP78 단백질의 발현량 21
[그림 33]/[그림 32] GRP78 발현 감소에 따른 세포 증식 억제 21
[그림 34]/[그림 33] GRP78 발현양에 따른 기존 항암제에 대한 감수성 21
[그림 35]/[그림 34] GRP78 발현에 따른 세포주기 변화(A) 및 세포 분열 변화(B) 21
[그림 36]/[그림 35] 다양한 세포주에서의 Gluc ASS1 promoter assay 테스트 22
[그림 37]/[그림 36] ASS1 promoter assay (A) 전략 및 ASS1 발현을 조절할 수 있는 약물 스크리닝(B) 22
[그림 38]/[그림 37] 간암세포주에서 아르기닌 단독 혹은 cisplatin 병용 투여에 의한 세포사멸능의 변화 23
[그림 39]/[그림 38] ASS1 발현과 고농도 아르기닌의 세포 사멸능. A. SNU475, B. Huh7, C. T48 24
[그림 40]/[그림 39] 아르기닌에 의한 간암 세포주의 migration assay 24
[그림 41]/[그림 40] 아르기닌에 의한 간암 세포주의 콜로니 형성 확인 24
[그림 42]/[그림 41] 아르기닌에 의한 간암 세포주의 해당과정 관련 효소들의 발현 변화 25
[그림 43]/[그림 42] 레퍼런스 SORD 단백질 염기서열 (NM_003104)과 한국인 SORD (Korean Clone ID: KU001957) 단백질의 CDS 염기서열의 비교 분석 결과 (insertion: 노랑색) (A). 레퍼런스... 25
[그림 44]/[그림 43] GRP78발현 억제제 개발 약물 스크리닝 플랫폼(A), GRP78 siRNA를 이용한 stable cell line 검증 (B) 26
[그림 45]/[그림 44] 스크리닝에서 수집한 이미지 분석 과정 26
[그림 46]/[그림 45] GRP78의 발현 억제 약물 발굴을 위한 pilot screenig 결과 26
[그림 47]/[그림 46] GRP78/GRP78 간의 상호작용 탐색을 위한 BRET assay 구축을 위한 plasmid 제작 및 최적의 BRET combination 선별 과정 27
[그림 48]/[그림 47] GRP78/GRP78간의 BRET 어세이에 대한 Geldanamycin의 용량 반응 곡선 28
[그림 49]/[그림 48] 유효약물의 in vivo 유효성을 검증하기 위한 간암 동소 이식 동물 모델 구축 28
[그림 50]/[그림 49] 데시타빈 처리에 의한 ASS1 발현량 변화 29
[그림 51]/[그림 50] 시스플라틴과 데시타빈 병용처리 시 세포 생존률 확인 29
[그림 52]/[그림 51] 시스플라틴과 데시타빈 병용처리 시 세포사멸 관련 단백질 발현량 확인 29
[그림 53]/[그림 52] HEK, Huh7, Hep3B 세포주에서 Geldanamycin에 의한 GRP78 단백질의 발현 변화 29
[그림 54]/[그림 53] geldanamycin에 의한 간암세포주의 세포생존율 30
[그림 55]/[그림 53] CPO와 유도물질인 LC-008, LC-011에 의한 GRP78 단백질 발현 30
[그림 56]/[그림 54] GRP78과 CPO (ligt blue stick), LC-008 (pink stick), LC-011 (green stick)의 결합 30
[그림 57]/[그림 55] ASS1 발현 증가 유효물질 병용처리 시 동종이식 동물모델에서의 항암효과 확인 31
[그림 58]/[그림 56] ASS1 발현 증가 유효물질 병용처리 시 종양 내 PARP 및 ASS1 발현 확인 31
[그림 59]/[그림 57] ASS1 발현변화 세포주에 아르기닌을 주입 후 종양의 크기(A) 및 무게(B) 변화 31
[그림 60]/[그림 58] (A) 두 가지 후보 약물을 주입한 후, 일정 기간 동안 측정한 종양의 크기, (B) 종양의 크기 비교, (C) 마우스의 무게 32
[그림 61]/[그림 59] ASS1 발현을 증가시키는 유효 약물로 도출된 약물 처리 시 동종 이식 동물 모델의 종양세포 내 조직 형상학적 분석 32
[그림 62]/[그림 60] 도출된 유효 약물 처리시 동종이식 동물모델에서 CD31의 발현 도출량 33
[그림 63]/[그림 61] Bioluminescence (Photon/sec) 결과 33
[그림 64]/[그림 62] ASS1 발현 증가 스크리닝 플랫폼을 이용하여 발굴한 약물(A.Decitabine, B.imecrolimus, C.HPI-1, D. JQ-1)에 의한 간암세포주의 구상체 크기 비교 34