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SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 23
제2장 국내외 기술개발 현황 26
제3장 연구개발내용 및 결과 28
제1절 식물생장 조절물질 대량생산 미생물 2차 선발 28
1. 보유균주 (Azospillirum, Methylobacterium) 중 식물생장조절물질(IAA) 대량 생산균 선발 28
2. 선발균주의 접종이 작물의 발아율 및 작물 PGR 함량에 미치는 영향 확인 32
3. 기내(in vitro)재배실험을 통한 접종 효과검정 32
제2절 PGR 생성균의 최적 접종방법 설정 37
1. 미생물 처리 농도에 따른 식물 생장 및 무기물질 함량 측정 37
2. 미생물 처리 방법에 따른 식물 생장 및 무기물질 함량 측정 41
3. 식물호르몬 함량 분석 44
4. 주사전자현미경 분석 46
5. 농약처리가 미생물 활성에 미치는 영향 46
제3절 포장실험을 통한 점종 효과 검증 및 사용법 확인 49
1. gfp 형질전환 균주 M. suomiense CBMB120의 구조와 gfp 유전자 합성 및 안정성 49
2. 작물 처리 시 접종효과와 군집화능 비교 50
3. 미생물 처리 작물에서의 군집능 확인 53
4. 미생물 처리 작물에서의 균주 밀도 측정 59
제4절 유전자 조작을 이용한 형질전환 PGR 생성균 제조 66
1. 형질전환용 벡터 선발 66
2. 균주의 형질전환 66
3. 형질전환체의 선발 71
4. 형질전환체의 gfp 활성 측정 74
제5절 형질전환 PGR 생성균을 이용한 토양 내 생존율 확립 80
1. 형질전환 PGR 생성균에서 도입 유전자의 안정성 80
2. 형질전환 PGR 생성균을 이용한 접종 미생물의 토양 내 생존율 측정 80
제6절 균주와 작물의 상호작용 89
1. 미생물 처리 방법에 따른 미생물의 개체내 분포 89
2. 식물에 접종된 미생물의 정량적 분석 94
3. 미생물 처리에 따른 발아율 변화 105
4. 미생물 처리에 따른 생장률의 증가 107
제7절 균체대량생산을 위한 산업용 배양 조건 확인 111
1. 저가형 탄소원의 선발 111
2. 저가형 질소원 선발 111
3. 미량 원소에 따른 균밀도 변화 115
4. 선발배지와 시판배지(DIFCO Bacto™ - TSB, LB, NB, PDB)에서의 균밀도 비교 115
5. 배양 온도에 따른 균밀도 변화 118
6. pH에 따른 균밀도 변화 118
7. 공기 주입량에 따른 밀도 변화 124
8. 임펠러 회전 속도에 따른 밀도 변화 124
9. Fermenter(500ℓ)를 이용한 최적 배지, 최적 조건에서의 균밀도 변화 비교 124
제8절 액상 생물 비료의 제제화 조건 확립 132
1. 액상 생물비료의 후보 물질 검색 132
2. 후보물질을 이용한 액상 생물비료의 장기 보존시험 132
3. 유효 후보 물질의 농도에 따른 액상 생물비료의 장기 보존시험 137
4. 전착제 성분이 액상 생물비료의 생존율에 미치는 영향 137
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 140
제5장 연구개발결과의 활용계획 145
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 146
제7장 참고문헌 153
표 1. 2차 선발 후 NCBI 등록한 식물생육촉진 엽권 미생물 및 등록 번호 29
표 2. 2차 선발 후 NCBI 등록한 식물생육촉진 근권 미생물 및 등록 번호 30
표 3. 2차 선발균주의 IAA 생성능 31
표 4. 식물생육촉진 엽권 미생물의 접종이 벼 유모의 t-ZR(trans-zeatin riboside), iPA(isopentenyladenosine) 및 IAA(indole-3-acetic acid) 농도에 미치는 영향 36
표 5. Methylobacterium oryzae와 Azospirillum brasilense 접종 밀도의 영향 39
표 6. 미생물 접종에 따른 고추 조직 내 영양 분석 (45 DAS) 40
표 7. 온실 조건에서 Methylobacterium oryzae strain CBMB20을 접종한 고추의 성장효과 42
표 8. 온실 조건에서 Methylobacterium oryzae CBMB20의 접종을 통한 고추 조직내 영양 분석 43
표 9. 온실 조건에서 Methylobacterium oryzae CBMB20이 접종된 고추의 줄기 및 뿌리의 Cytokinin 축적 45
표 10. 농약 처리 시 nitrogenase의 활성능과 IAA 생성능, P의 가용화에 미치는 영향 48
표 11. 벼에 접종한 균주의 경과일에 따른 총 밀도와 CBMB120 -gfp29의 밀도 64
표 12. 토마토에 접종한 균주의 경과일에 따른 총 밀도와 CBMB120 -gfp29의 밀도 65
표 13. 형질전환한 미생물과 형질전환 방법 68
표 14. 유세포 분류기에서 형질전환 된 Methylobacterium과 Azospirillum에서 gfp 형광을 띠는 박테리아의 비율 76
표 15. 형질전환 된 Methylobacterium과 Azospirillum에서 PCR을 이용한 각 계대배양 횟수에 따른 도입된 유전자의 안정성 확인 83
표 16. 형질전환 된 미생물 정량에 사용된 Real-Time PCR용 primer 99
표 17. 형질전환 된 미생물을 고추종자에 균처리하여 얻은 고추잎에서 여러 가지 방법으로 추출한 후 Real-Time PCR을 이용하여 정량한 박테리아 수 104
표 18. 형질전환 된 미생물을 고추종자에 엽면시비 및 근권접종과 종자침지하여 얻은 고추잎에서 부위별 DNA 추출 후 Real-Time PCR을 이용하여 정량한 균주밀도 106
표 19. 탄소원 종류에 따른 Methylobacterium과 Azospirillum의 밀도 112
표 20. Glucose 첨가량에 따른 Methylobacterium과 Azospirillum의 밀도 113
표 21. 질소원 종류에 따른 Methylobacterium과 Azospirillum의 밀도 114
표 22. 대두분 첨가량에 따른 Methylobacterium과 Azospirillum의 밀도 116
표 23. 미량 원소에 따른 Methylobacterium속과 Azospirillum속의 밀도 117
표 24. 선발배지와 시판배지에서의 균밀도 비교 119
표 25. 첨가물질에 따른 Methylobacterium (CBMB20)의 생존율 변화 133
표 26. 첨가물질에 따른 Azospirillum (CW301)의 생존율 변화 134
표 27. 첨가물질에 따른 Methylobacterium (CBMB20)의 생존율 변화 135
표 28. 첨가물질에 따른 Azospirillum (CW301)의 생존율 변화 136
표 29. 유효 첨가물질의 농도에 따른 Methylobacterium (CBMB20)의 생존율 변화 138
표 30. 유효 첨가물질의 농도에 따른 Azospirillum (CW301)의 생존율 변화 139
그림 1. 식물생장 촉진 미생물 접종 후 벼 유묘의 기내 배양 33
그림 2. 식물 생육 촉진 엽권 미생물 접종이 벼의 유묘 생육에 미치는 영향 (V3 stage) 34
그림 3. Cytokinines(iPA, t-ZR)의 측정을 위한 ELISA 35
그림 4/5. 미생물의 처리농도와 처리방법에 따른 고추의 생장측정 실험 38
그림 5/6. 기내에서 재배한 유묘의 전자 현미경 사진.... 47
그림 6/7. 0.05% succinate가 첨가된 AMS배지에서 측정한 CBMB120 CBMB120-gfp29 의 개체수와 벼와 토마토에서의 식물 생장 촉진.... 51
그림 7/8. TSA배지에서 측정한 CBMB120, CBMB120-gfp29 의 개체수와 벼와 토마토에서의 식물 생장 촉진.... 52
그림 8/9. CBMB120과 CBMB120-gfp29를 접종한 벼와 토마토 유묘의 뿌리 신장 54
그림 9/10. CBMB120과 CBMB120-gfp29를 접종한 벼와 토마토 유묘의 건조 중량 55
그림 10/11. 벼 뿌리와 잎의 CBMB120-gfp29 군집... 57
그림 11/12. 토마토의 잎과 뿌리의 CBMB120-gfp29 군집... 58
그림 12/13. 벼의 잎과 뿌리에 분포한 M. suomiense CBMB120.... 60
그림 13/14. 토마토의 잎과 뿌리에 분포한 M. suomiense CBMB120... 61
그림 14/15. 형질전환에 사용된 벡터에서 미생물에 도입되는 minitransposon의 구조.... 67
그림 15/16. PCR을 이용한 형질전환 된 Methylobacterium의 선발,... 72
그림 16/17. 형질전환 된 Azospirillum CW301, CW903, CW1503의 β-galactosidase 활성 73
그림 17/18. 유세포분류기를 이용한 형질전환 Methylobacterium CBMB20 중에서 gfp 형광을 띠는 박테리아의 비율 분석.... 75
그림 18/19. CLSM을 이용한 형질전환 된 Methylobacterium CBMB20-pFAJ1820의 gfp 형광 측정.... 77
그림 19/20. CLSM을 이용한 형질전환 된 Methylobacterium CBMB110-pFAJ1820의 gfp 형광 측정.... 78
그림 20/21. CLSM을 이용한 형질전환 된 Azospirillum CW903-pFAJ1820의 gfp 형광 측정.... 79
그림 21/22. PCR을 이용한 형질전환 된 Azospirillum 의 안정성 측정,... 81
그림 22/23. PCR을 이용한 형질전환 된 Methylobacterium 의 안정성 측정,... 82
그림 23/24. CHOI 항생제 배지를 이용한 토양에서 분리한 형질전환 된 Methylobacterium의 선별 84
그림 24/25. PCR을 이용한 Methylobacterium 선별배지에서 살아남은 토양에서 분리한 미생물의 형질전환 여부 확인.... 86
그림 25/26. 여러 가지 토양에서 Methylobacterium의 생존율 측정실험 87
그림 26/27. 여러 가지 토양에서 처리 후 일수에 따른 형질전환 된 Methylobacterium CBMB20의 생존율 88
그림 27/28. 엽면시비와 근권접종 2일 후 고추잎에서 CLSM 촬영.... 90
그림 28/29. 엽면시비와 근권접종 8일 후 고추잎에서 CLSM 촬영.... 91
그림 29/30. 엽면시비와 근권접종 8일 후 고추의 줄기에서 CLSM 촬영.... 92
그림 30/31. 엽면시비와 근권접종 8일 후 고추의 뿌리에서 CLSM 촬영.... 93
그림 31/32. 고추종자 침지 접종 14일 후 자엽에서 CLSM 촬영.... 95
그림 32/33. 고추종자 침지 접종 21일 후 제1 본엽에서 CLSM.... 96
그림 33/34. pFAJ1820의 특이적인 primer 쌍을 제작하기 위한 primer의 위치 98
그림 34/35. Real-Time PCR을 이용한 작물에 처리된 형질전환 미생물의 수 정량.... 102
그림 35/36. Methylobacterium CBMB20 처리에 따른 고추, 토마토, 상추, 및 벼의 발아율 108
그림 36/37. 고추에서 Azospirillum CW903의 처리에 따른 생장률의 변화 109
그림 37/38. 고추에서 Azospirillum CW903의 처리에 따른 각 기관별 생장 차이 110
그림 38/39. 온도에 따른 Methylobacterium(CBMB20)의 균밀도 변화 120
그림 39/40. 온도에 따른 Azospirillum(CW301)의 균밀도 변화 121
그림 40/41. pH에 따른 Methylobacterium(CBMB20)의 균밀도 변화 122
그림 41/42. pH에 따른 Azospirillum(CW301)의 균밀도 변화 123
그림 42/43. 공기 주입량에 따른 Methylobacterium(CBMB20)의 균밀도 변화 125
그림 43/44. 공기 주입량에 따른 Azospirillum(CW301)의 균밀도 변화 126
그림 44/45. 임펠러 회전속도에 따른 Methylobacterium(CBMB20)의 균밀도 변화 127
그림 45/46. 임펠러 회전속도에 따른 Azospirillum(CW301)의 균밀도 변화 128
그림 46/47. Jar Fermenter(5ℓ)와 Fermenter(500ℓ)에서의 Methylobacterium(CBMB20) 균밀도 변화 130
그림 47/48. Jar Fermenter(5ℓ)와 Fermenter(500ℓ)에서의 Azospirillum(CW301) 균밀도 변화 131