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서문
목차
연구의 요약 6
제1장 유전자변형생물체에 대한 과학적 지식의 축적 32
1. 향후 실용화가 예상되는 유전자변형생물체의 환경안전성 평가기술의 개발 34
가. 유전자변형 식물체에 대한 환경안전성 평가기술의 개발에 관한 연구 34
1) 유전자변형 목초의 안전성에 관한 연구 34
가) Sucrose phosphate synthase 유전자 도입 톨페스큐의 안전성평가 34
나) 유전자변형 목초류의 유전자이동 평가를 위한 기초 연구 39
다) 충매목초 Lotus속 등을 이용한 개방계로의 유전자이동 및 환경영향 평가법의 개발 44
(1) Lotus속 목초의 개방계에 있어서의 유전자이동 평가법의 개발 44
(2) 알팔파의 화분 이동성 및 도입유전자의 영향 평가 47
(3) 다년생 수수(sorghum)의 번식 양식 및 잡종 형성에 의한 확산성 평가 54
(4) 기니아그라스(Panicum maximum)의 잡종형성에 의한 유전자 이동성의 평가 61
2) 신규 유전자변형 식물의 환경에 미치는 안전성평가에 관한 연구 64
가) 유전자변형 식물이 농업 생태계에 미치는 작용의 검출을 위한 화학 생태학적 기술의 개발 64
나) 옥수수 유래의 C4 광합성 관련 유전자를 도입한 벼의 환경 영향을 위한 새로운 안전성평가 항목의 검토 72
다) 유전자변형 키위 열매의 안전성평가 항목의 검토 및 근권환경의 영향 평가 82
라) 유전자변형 사과의 실용화를 위한 장기 영향평가 90
나. 유전자변형 수목의 환경안전성 평가기술의 개발에 관한 연구 94
1) 유전자변형 버드나무의 안전성 평가기술의 개발 94
가) 유전자변형생물체 버드나무의 개발 및 근권환경에 미치는 영향에 대한 조사 94
나) 유전자 변형 버드나무의 격리 온실 육성과 조사 100
다. 유전자변형 동물의 환경안전성 평가기술의 개발에 관한 연구 106
1) 유전자변형 가축의 실용화를 위한 안전 평가 연구 106
가) 배설물 시료에서 DNA 추출 및 유전자 검출법 확립 106
나) 유전자변형 가축의 개발과 그 과정에서 도입유전자 검출 112
다) 야외 사육지 토양에서의 가축 유래 유전자의 검출 115
2) 유전자변형 어류에 관한 안전성 관리 기술의 개발 118
가) 목적 118
나) 연구 방법 118
다) 결과 119
라) 고찰 122
마) 향후의 과제 123
바) 요약 123
사) 문헌 124
라. 유전자변형 미생물의 환경안전성 평가방법 개발에 관한 연구 124
1) 환경 미생물의 안전성평가 기술의 개발에 관한 연구 124
가) 키티나제(chitinase) 유전자 도입 세균에 의한 생물학적 방제기술 개발 124
나) 환경 복구를 목적으로 한 유전자변형 미생물의 유전자 이동·확산의 평가 135
다) 유용 유전자변형 미생물에서의 suicide 시스템의 발현 제어 147
2) 식품 미생물의 안전성평가 기술의 개발에 관한 연구 155
가) 셀프클로닝으로 개발한 제빵용 효모의 환경 영향 평가 기술에 관한 연구 155
나) 유전자변형 누룩곰팡이 등의 환경 안전 평가 기술에 관한 연구 161
다) 된장 제조 시험실·공장으로부터 확산되는 누룩곰팡이의 이동 실태 조사 166
라) 실험실·공장으로부터의 낫도균의 이동 실태 조사 173
판권기
표 1-1. 형질전환 롤페스큐의 건조잎 분말에 대한 배양토의 혼입이 이탈리안 라이그라스(L. multiflorum)의 생육(생체중)에 미치는 영향 35
표 1-2. 형질전환 롤페스큐의 뿌리의 잔재물이 이탈리안 라이그라스(L. multiflorum)의 생장(건물중)에 미치는 영향 35
표 1-3. 형질전환 롤페스큐의 건조잎 분말에 대한 배양토의 혼입이 붉은 토끼풀의 생장(초장)에 미치는 영향 35
표 1-4. 형질전환 롤페스큐의 건조잎 분말에 대한 배양토의 혼입이 알팔파의 건물중에 미치는 영향 35
표 1-5. 형질전환 롤페스큐의 건조잎 분말이 양상추 하배축과 뿌리의 신장에 미치는 영향 36
표 1-6. 형질전환 롤페스큐(103계통)로부터 일반 품종으로 화분에 의한 재조합 유전자 이동 36
표 1-7. 형질 전환 롤페스큐와 비형질 전환 롤페스큐의 방임 수분 후대의 발아세 37
표 1-8. 화분체취후의 시간과 발아율의 관계 41
표 1-9. 자식 조건하에서의 임실률 42
표 1-10. 잔디의 종자생산 특성 42
표 1-11. 흰토끼풀용으로 개발 된 SSR 마커의 서양벌노랑이의 증폭 및 다형성 검출의 비교 46
표 1-12. 5~9월에 알팔파포장에서 관찰된 방화곤충종 49
표 1-13. 알팔파의 방화곤충종과 콩과초종의 선호순위 50
표 1-14. 알팔파 화분의 다른 초종 주두로의 발아도 50
표 1-15. 생명공학식물 방사 45일 후의 증식개체수 51
표 1-16. 복부 마쇄액으로부터 발생한 콜로니수1)과 벌크 DNA로부터 PCR 그리고 HPT-35S 프로모터 유전자가 검출된 사례수(샤레수) 52
표 1-17. 다년생 수수의 월동성과 종자의 자식임성 57
표 1-18. 「세포질 웅성불임계통 X다년생 수수」의 방임수분 후대의 생육특성 59
표 1-19. 월동 후 맹아(萌芽)한 개체의 상대적 DNA함량 60
표 1-20. 초지와의 거리와 유성생식 계통의 착립수, 착립비율 및 후대 발아율, 교잡성 62
표 2-1. 타감물질활성 검정에 적절한 식물의 예 67
표 2-2. 유전자변형 및 일반벼의 토양 미생물상 조사 69
표 2-3. 유전자변형 근류균을 접종한 자운영의 토양 미생물상 69
표 2-4. 다른 온도 조건하에서의 야생형 및 유전자변형 자운영 근립균의 성쇠 70
표 2-5. 옥수수 유래 C4형 PEPC 유전자를 도입한 PEPC 벼의 각 단계에서 평가 항목 74
표 2-6. 개영후의 화분의 발아율의 변동 75
표 2-7. 매벼(맵쌀, 일반미) 근처에서 생육한 찰벼 후대에 매벼성(粳性)의 출현 화분 비산 거리 76
표 2-8. 벼 재배 토양에서 근권토양법에 의한 타감물질의 검출 79
표 2-9. 유전자변형생물체로 감소한 단백질의 아미노산 배열과 상동성 검색의 결과 85
표 2-10. 유전자변형생물체 재배 토양중의 토양 미생물상 87
표 2-11. 유전자변형생물체 재배 토양 속의 토양 미생물 바이오매스량 89
표 2-12. 사과에 대한 타감물질성의 검정 92
표 2-13. 과수원 잡초에 대한 타감물질성의 검정 92
표 3-1. 시료균 96
표 3-2. 균근균을 접종한 은버들의 생존상황 96
표 3-3. 절단 한 균근팁(tip)으로부터의 균근균의 분리 97
표 4-1. 마우스 배설물에서 추출한 DNA량 및 순도 108
표 4-2. 유전자변형 마우스 배설물 중 DNA의 정량 분석 111
표 4-3. 유전자변형 모델 미니돼지의 개발 114
표 4-4. 유전자변형 미니돼지 개발 과정에서 배설물 중의 도입유전자의 검출 114
표 4-5. 토양 중에서 검출된 염소게놈 DNA 검출 116
표 5-1. 개발한 유전자변형 미생물의 카르바릴에스테라제(carbarylesterase)활성 137
표 5-2. 멸균 토양에서 유전자변형생물체의 생존성 및 분해능력 유지 139
표 5-3. cehA를 포함한 각 DNA 단편 (pBI101상)의 접합빈도 139
표 5-4. 토양에서 핵외유전자 전달시험의 시료균주의 구성 142
표 5-5. 균의 구성이 핵외 유전자의 전달빈도에 미치는 영향 (in vitro) 142
표 5-6. 온도 및 영양조건이 핵외 유전자의 전달빈도에 미치는 영향 (in vitro) 144
표 6-1. 실험 공장에서의 균수 측정 결과 170
표 6-2. 실험공장에서 창 및 환기팬에 의한 장외 확산 상황 171
표 6-3. 된장 제조공장의 균수 측정 결과 172
표 6-4. 활성 진흙내의 청국장균수의 변화 176
표 6-5. 멸균 토양내 청국장균수의 변화 176
표 6-6. 멸균사내의 청국장균수의 변화 177
그림 1-1. 103(형질전환체)과 N13(비형질전환체)의 교잡 후대에 있어서의 발아 시간 및 유전자변형식물 유래 유전자 유무와의 관계 37
그림 1-2. 103의 방임 수분 후대에 있어서의 발아 시기와 재조합 유전자의 유무의 관계 38
그림 1-3. 다른 시간에 채취한 화분의 발아율 40
그림 1-4. 화분원으로부터의 거리와 종자임실률의 관계 41
그림 1-5. 일본산벌노랑이(왼쪽)와 서양벌노랑이(오른쪽)의 형질전환체 45
그림 1-6. PCR에 의한 항생물질 내성유전자 hph의 검출 45
그림 1-7. 흰색클로버의 SSR용 프라이머 (TRA02C04)에 의한 서양벌노랑이 각 계통의 다형성 46
그림 1-8. 서양벌노랑이에서 SSR 마커(TRA02C04 프라이머 사용)의 후대에의 전달 47
그림 1-9. 알팔파의 화분 수명(한천 배지상에서의 화분관 발아율) 50
그림 1-10. 화분 공급원으로부터 떨어진 거리와 교잡율 51
그림 1-11. 파종 3년째의 지하경의 확대 56
그림 1-12. 다년생 수수에 있어서의 누적 탈립 비율의 변화 56
그림 1-13. 수수 화분의 비산 거리 57
그림 1-14. 자식임성이 없는 존슨글래스를 1 년생 수수와 존슨글래스 재배포장에서 채종했을 때의 1이삭당 정선종자의 무게와 천립의 무게 58
그림 1-15. 화분원으로부터 거리에 설치한 저녁램형 화분 채집기에 포집된 개화 전성기의 거리 화분수 62
그림 1-16. 화분수(개/㎠)와 착립율(%)의 관계착립율과 화분수를 동시에 관측했다.... 63
그림 2-1. 근권토양법에 따른 검정의 개념도 67
그림 2-2. 근권토양 및 뿌리 지역 토양이 양상추 뿌리 성장에 미치는 영향(근권토양법)... 68
그림 2-3. 모세관 전기영동법에 따르는 타감물질의 분석 예 69
그림 2-4. 인공 논 | 재배도 77
그림 2-5. 저온 내성 실험 77
그림 2-6. 근권토양법에 의한 타감물질의 검출 79
그림 2-7. 비유전자변형생물체(A)와 유전자변형생물체(B)의 단백질의 이차원 전기영동 84
그림 2-8. 지베렐린 처리 후의 경엽(상단)과 잎의 형태... 85
그림 2-9. 고온 스트레스 (37℃)후의 유전자변형생물체와 비유전자변형생물체에 있어서의 단백질의 지점 패턴 86
그림 2-10. 후지이식 샌드위치법에 따른 키위열매 유전자변형생물체 및 비유전자변형생물체의 타감물질 검정 86
그림 3-1. 유전자변형생물체에 감염, 균근형성한 Pisolithus tinctorius f. tinctorius 균을 피층부로부터 분리 98
그림 3-2. 은버들과 Pisolithus tinctorius f. tinctorius로부터 추출한 DNA를 이용한 PCR 98
그림 3-3. 형질 전환 버드나무의 조직 부위별 GUS 유전자 발현의 차이 101
그림 3-4. 배양토양에서 도입 선발 마커 유전자 nptll의 PCR 증폭 102
그림 3-5. 유전자변형 버드나무의 타감물질... 103
그림 3-6. 유전자변형 버드나무의 타감물질... 103
그림 3-7. 유전자변형 버드나무의 타감물질... 104
그림 3-8. 유전자변형 잡종 버드나무의 타감물질... 104
그림 4-1. 마우스 배설물 유래 DAN의 영동 108
그림 4-2. 마우스 배설물 중의 EGFP 유전자의 검출 108
그림 4-3. 배설물 중의 r-액틴 유전자의 검출 109
그림 4-4. 마우스 사육 환경하에서 사육된 유전자변형 마우스 배설물 유래 유전자 검출 109
그림 4-5. 배설물중에 포함되는 게놈 DNA의 정량 110
그림 4-6. 유전자변형 마우스 배설물 중의 EGFP 유전자와 actin 유전자의 양적 상관관계 110
그림 4-7. 도입유전자의 구조 113
그림 4-8. 보통 야외사육 조건하에서 보존한 염소 배설물 중의 게놈 DNA 검출 117
그림 4-9. 유전자변형 산천어 대변에서 도입유전자의 검출 120
그림 4-10. 장내세균과 핵외유전자의 혼합 배양 120
그림 4-11. 사육수를 동결건조해 석출되어 나온 분상물에서 도입유전자의 검출 121
그림 4-12. 사육수 중에 공생하는 미생물과 핵외유전자의 혼합 배양 121
그림 4-13. 2배체와 3배체의 정소 122
그림 4-14. 유전자변형생물체 산천어와 대조구 산천어의 비장에서 발현되는 단백질의 2차원 전기영동 양상 비교 122
그림 5-1. 염색체 도입 벡터의 구축법 125
그림 5-2. 공기포집기(air sampler)에 의한 공중 부유균의 시료 채취 125
그림 5-3. 유전자변형 엽면세균에 의한 회색곰팡이병 제어효과 128
그림 5-4. 오이모종 회색곰팡이병의 발병 억제효과 129
그림 5-5. 근권세균의 정착성 129
그림 5-6. 오이엽면에서 E. ananas의 생존성 130
그림 5-7. 토양 중에서 생존성 130
그림 5-8. 공중부유세균과 낙하세균의 추적 130
그림 5-9. 엽면에 상주하는 세균수의 추이 131
그림 5-10. 엽면 사상균의 출현 빈도 131
그림 5-11. 사용한 유전자(cehA (EB), Tnceh (EE)) 137
그림 5-12. in vitro, 멸균토양 및 비멸균토양에서 접합전달균주 수의 비교... 144
그림 5-13. 멸균토양(논토양)에서 접합 전달균주 수의 시간 흐름에 따른 변화... 145
그림 5-14. 토양에 접종한 시료균주의 생존성 145
그림 5-15. Southern hybridization에 의한 cbn 유전자가 염색체에 도입되는 것을 확인 148
그림 5-16. 제작한 선택 배지에 의한 KC8균주 분리 150
그림 5-17. 토양내에서 KC8균주의 생존성 150
그림 5-18. 토양내 3CB 농도 변화 150
그림 5-19. 생육 저해유전자의 스크리닝 시스템 151
그림 5-20. 3CB에 의한 PR 프로모터의 발현억제 152
그림 5-21. 생육 저해 유전자의 일차 스크리닝 153
그림 6-1. 본 과제에서 사용한 모델 환경 158
그림 6-2. 모델 폐수 중에서 생균수·특이적 DNA단편수 추이 159
그림 6-3. 모델 토양중에서 생균수·특이적 DNA 단편수 추이 159
그림 6-4. 흑토중의 PTR-1주의 변동 164
그림 6-5. 천사중의 PTR-1주의 변동 164
그림 6-6. 흙중의 TB-1주의 변동 164
그림 6-7. 천사 중의 TB-1주의 변동 164
그림 6-8. 수도물 중의 PTR-1주의 변동(시험1) 164
그림 6-9. 수도물중의 PTR-1주의 변동(시험2) 164
그림 6-10. 수도물중의 TB-1주의 변동 165
그림 6-11. 생활쓰레기 처리기안의 PTR-1주의 변동 165
그림 6-12. 실험 공장 시료채취 지점 168
그림 6-13. 된장 제조공장 시료채취 지점 169
그림 6-14. 계측용 배지를 이용한 대기중 균수측정 169
그림 6-15. 청국장균의 공장바깥으로 확산되는 경로 175
그림 6-16. 증기솥 175
그림 6-17. 청국장균 접종 작업 175