우리나라의 주요 작물인 쌀은 최근 웰빙 붐으로 인해 세계적으로도 점점 그 중요성이 증가되고 있다. 국내 벼농사의 기술 수준은 오랫동안 품종 개량과 재배법, 농업 기계, 방제 기술의 발달 등과 아울러 상당히 고도화되었다고 할 수 있지만, 최근의 온난화의 영향에 의해 수율, '외관 품질', '맛'의 3점을 모두 충족한 품질을 안정적으로 얻으려면 추가적인 기술 혁신이 절실히 필요하다. 근권에 주어진 질소원이 주로 종자 형성에 크게 영향을 미칠 것이 예측되기 때문에, 종자 내의 대사 변화나 저장 물질량의 축적 메카니즘을 해명하는 것이 가능해진다고 생각했다. 그리고 이러한 메커니즘을 해명하는 것은 쌀의 집적 물질, 즉 품질에 영향을 미치는 요인의 해명으로 이어진다.
따라서 본 연구는 분자 생물학적 방법을 이용하여 쌀에서 아미노산 수송체 관련 유전자들을 이용하여 유전자 교정체 육성과 후대 종자 내의 성분 변화를 연결하여 쌀의 생산성과 품질 향상에 대해 결과를 요약해보면 다음과 같다.
1. 아미노산 수송체 관련 타켓 유전자의 구조분석을 수행한 결과 OsAAT5 유전자는 벼 1번 염색체에 위치하고 있으며, 게놈 크기가 3.62 kb로서 4개의 엑손으로 이루어져 있고, cDNA는 2103 bp로 701개의 아미노산으로 이루어져 있다. OsATL7는 벼 1번 염색체에 위치하고 있으며, 게놈 크기가 6.38 kb로서 5개의 엑손으로 이루어져 있고, cDNA는 1323 bp로 441 개의 아미노산으로 이루어져 있다. OsAAP10는 벼 2번 염색체에 위치하고 있으며, 게놈 크기가 7.41 kb로서 7개의 엑손으로 이루어져 있고, cDNA는 1383 bp로 461 개의 아미노산으로 이루어져 있다.
2. 변이체 육성을 위하여 sequencing을 통해 안정적으로 구축이 확인된 CRISPR/Cas9 벡터는 6개로, 각 각 pBOsC::AAT5_sg1, pBOsC::AAT5_sg2, pBOsC::ATL7_sg1, pBOsC::ATL7_sg2, pBOsC::AAP10_sg1, pBOsC::AAP10_sg2로 명명하였다. 구축이 확인된 벡터는 Agrobacterium tumefaciens EHA105를 매개로하여 동진 벼 callus에 감염하였다.
3. 감염된 callus는 멸균된 필터페이퍼 위에서 건조시키고 3일간 암배양하여 세척한 뒤 치상하고 4주간 암배양 하였다. 신초 형성을 위해 callus를 MSR 배지로 옮겨 2주 마다 계대배양하고, 신초가 형성되면 뿌리를 유도하여 형질전환체를 육성하였다.
4. 재분화 개체의 T-DNA 도입 여부를 확인하기 위하여 식물체로부터 DNA를 추출하고, pBOsC 벡터의 bar 유전자와 nos 터미네이터 영역의 프라이머를 제작하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환 여부를 검토하기 위해 PCR 분석을 수행한 결과, OsAAT5 유전자의 교정체 육성한 것 중 sgRNA1 30개체, sgRNA2 15개체 모두에서 양성반응을 보였다. OsATL7 유전자 교정체 역시 sgRNA1 30개체, sgRNA2 15개체 모두에서 양성반응을 보였다. 또한 OsAAP10 유전자의 교정체도 sgRNA1에서 32개체, sgRNA2에서 30개체 모두에서 양성반응을 보였다.
5. 형질전환 벼 개체 중 유전자 교정 비율은 유전자 및 sgRNA 따라 큰 폭으로 나타나 최고 92%, 최저 7% 변이효율을 보였다. 이들 유전자 교정체는 homo-allelic 개체, bi-allelic 개체, hetero-allelic 개체의 변이 유형으로 나타났다.
6. 교정체로부터 T₁ 식물체를 육성하여 모든 식물체의 잎 하나에 basta 4 ppm 용액을 처리해 주었으며, 동시에 bar strip을 이용하여 null 개체를 선발하여 계통화 하였다.
7. OsAAT5, OsATL7 및 AAP10 유전자 교정체 T₃ 계통의 주요 농업 형질인 초장, 간장, 수장, 분얼수 등을 조사하였다. 그 결과 OsAAT5, OsATL7 및 AAP10 유전자 교정체의 초장, 분얼수, 간장, 수장 모두 WT보다 높은 값으로 나타났다.
8. 종자 외관과 전분 과립은 실체현미경과 주사전자현미경을 통해 종자의 형태적 변화를 관찰한 결과 OsAAT5, OsATL7 및 OsAAP10 유전자 교정계통의 종자의 과립에는 크게 영향을 주지 않았다.
9. OsAAT5, OsATL7 및 OsAAP10 유전자 교정계통 후대를 이용하여 비색법을 통해 아밀로스 함량을 분석한 결과 WT의 아밀로스 함량이 18.8%, OsAAT5 계통은 각 각 18.5%, 18.6%, OsATL7 계통은 19.9%, 19.7%, OsAAP10 계통은 19.1%, 19.0%로 나타났다.
10. OsAAT5, OsATL7 및 OsAAP10 유전자 교정계통과 WT는 같은 A형 과립형태를 보인 것을 미루어 볼 때 AAT 유전자교정에따라 전분 결정 구조에 영향을 주지 않음을 시사한다.
11. RVA(Rapid Visco Analyser)는 ECQ(eating and cooking quality)를 측정하는 방법 중 하나로, 시간 및 온도에 따른 점도의 변화에 따라 식미의 특성을 분석한 결과 유전자 교정 계통에서 특별한 차이를 보이지 않았다.
12. OsAAP10 교정계통에서 아미노산 함량 분석한 결과 WT에비해 아르기닌 (Arg), 글루탐산 (Glu) 및 알라닌 (Ala)함량이 높게 나타났다.
13. AAT 계열 유전자는 질소 흡수 및 분배의 주요 인자로 식물의 자원 할당의 중요한 조절자 이기 때문에 WT 및 유전자 교정 계통의 잎으로부터 탄소 및 질소의 함량을 측정한 결과 OsAAP10 변이체에서 탄소의 농도는 약 3% 증가하였으며, 질소의 농도는 약 12% 증가하였다.
이상의 결과로부터 아미노산수송체 관련 OsAAT5, OsATL7 및 OsAAP10 유전자교정계통은 source 조직의 증가를 통해 전 생육동안 biomass를 증진한 것으로 생각된다.