표제지
적요
목차
Ⅰ. 서론 11
Ⅱ. 재료 및 방법 15
1. 실험재료 15
1.1. LB medium 15
1.2. Antibiotic 15
1.3. Bacterial Strains 15
1.4. Plasmid vectors 16
1.5. IPTG 18
2. 실험방법 19
2.1. Chromosomal DNA 추출 19
2.2. PCR 19
2.3. PCR purification 및 gel extraction 22
2.4. Agarose gel 전기영동 22
2.5. 제한효소 처리 23
2.6. Ligation 23
2.7. Transformation 24
2.8. Mini culture & 전배양 24
2.9. Plasmid DNA mini preparation 24
2.10. 뉴클레오타이드 염기서열 분석 25
2.11. 대장균에서의 recombinant protein expression 25
2.12. Soluble protein 분리 26
2.13. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 분석 26
2.14. Bradford assay 27
2.15. Protein purification 28
2.16. 재조합 heparinase II 활성 측정 30
Ⅲ. 결과 32
1. Pedobacter heparinus heparinase II 유전자 확보 32
2. 대장균 발현 vector와 heparinase II 유전자 클로닝 확인 33
3. Nucleotide sequence alignment 34
4. 대장균에서의 재조합 heparinase II 발현 확인 37
4.1. 발현조건 분석 37
5. 재조합 heparinase II 단백질 정제 41
5.1. 1차 정제 (Ni-IDA affinity chromatography) 41
5.2. Buffer change 43
5.3. 2차 정제 (Cation exchange chromatography) 43
5.4. 재조합 heparinase II 효소 활성 측정 45
Ⅳ. 고찰 47
Ⅴ. 참고 문헌 50
Abstract 52