Background
Heparin은 glycosaminoglycan(GAG) 계열의 다당류 중에 가장 복잡한 구조를 가졌으며, uronic acid와 D-glucosamine(GlcN)이 α- (1,4) 글리코시드 결합에 의해 반복적인 형태를 이루고 있는 이당류 소단위체로 구성된 선형 다당류의 일종이다. Heparin의 피부 국소 도포의 경우 비정상적인 세포증식을 억제해 흉터 생성 완화 연고로도 주로 사용되고 있으며, 친수성이 높은 고분자 다당류 성분으로 콜라젠 생성, 피부 진정, 피부 장벽 수분 케어, 피부결 케어와 같은 기능을 가지는 것으로 알려져 피부에 도움을 주는 화장품 및 의약산업적 가치가 높은 것으로 판단되고 있으나, 고분자 heparin의 경우 피부 내 침투율이 낮으므로 저분자화를 통해 침투율을 높임으로써 화장품 소재로의 효율을 증가시켜야 한다. 본 연구는 Pedobacter heparinus 유래의 heparinase II 유전자의 cloning을 통해 얻어진 재조합 heparinase II를 발현 및 정제하여 얻어진 heparin 분해 효소를 사용하여 고분자의 heparin을 저분자화 하고자 한다.
Method and result
재조합 heparinase II의 확보를 위해 해당 유전자를 Pedobacter heparinus로 부터 분리하여 대장균에 cloning 하였으며, IPTG 첨가 농도, 배양온도, 배양시간 별로 조사한 결과, 0.05mM IPTG 농도, 배양온도 30℃, 배양시간 6시간의 조건에서 가장 가용성 단백질(soluble protein)이 최적 발현되는 것으로 확인되었다. E. coli BL21 (DE3) (pET28a-heparinase II) 형질전환체가 앞의 최적 배양조건의 50mL 배양액 균체에서 확보한 crude extracts 용액을 3단계 과정을 통해 정제하였으며 centrifugation 후 상층액의 단백질 농도는 44.45μg/ml, Ni-IDA affinity chromatography 후 단백질 농도는 28.8μg/ml, buffer change를 진행한 결과, 단백질 농도는 24.4μg/ml이었으며 ion exchange chromatography 후 단백질 농도는 5.8μg/ml로 확인되었으며 각 단계의 정제로 heparinase II 단백질의 순도가 올라갔으나 전체 단백질의 양은 줄어들었음을 확인하였다. Ni-IDA affinity chromatography 후 2차 정제로 cation exchange chromatography를 진행하여 확보한 elution protein 0.02μg/ml에서 1.21μmole/min/μg의 효소 활성이 있음이 확인되었다.
Conclusion
Heparinase II의 heparin 분해 활성을 확인한 결과, 정제과정 중 heparinase II의 순도는 증가하였으나 dialysis에 의한 buffer change 과정 중 사용한 저온(4℃) 완충액의 급격한 온도 및 농도 변화로 인한 단백질 응집으로 heparinase II의 효소 활성이 감소한 것으로 판단된다. 본 연구를 통해 확보한 heparinase II 효소를 사용하여 고분자 heaprin의 저분자화가 가능함을 확인하였고, 향후 추가연구를 통하여 저분자화 heparin이 세포증식을 더욱 촉진하는 것을 확인하여 기능성 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인할 수 있을 것이다.