본 학위 논문에서는 천연 고분자 저 분자량 수용성 키토산 (LMWSC)과 히알루론산 (HA) 그리고 anthocyanin에 다양한 기능성 물질이 도입된 약물을 개발하여 그 치료 효율을 입증하였다.
Part I에서는 천연 고분자 저 분자량 수용성 키토산 (LMWSC)을 이용해서 약물 전달체를 제조하여 그 효능을 평가하고자 하였다. 약물 전달체는 친수성 물질인 LMWSC와 소수성 물질인 lauric acid (LA) 사이에 화학적 작용을 통해 LMWSC-g-LA (LMLA)를 합성하였다. 합성된 LMLA의 구조적인 특성은 ¹H-NMR을 이용하여 확인 하였으며, 그 결과 특성 피크들을 모두 확인 함으로써 성공적으로 합성 되었음을 알 수 있었다. 또한, 임계응집농도 (CAC) 실험을 통해 0.0351 mg/mL의 낮은 농도에서도 입자가 형성되는 것을 확인하였다.
실험에서 항암제로 사용된 flufeanmic acid (FA)가 담지된 LMLA (LMLAF) 나노입자는 evaporation 및 투석법을 이용하여 제조하였다. LMLA와 LMLAF의 입자 구조는 구의 형태를 이루고 있었으며, 입자의 크기는 240 ~ 320 nm의 단 분산 형태의 입자를 형성하고 있음을 확인하였다. 또한, LMLAF의 표면 전하는 27 ~ 32 mV로 강한 양전하를 나타냄을 확인 할 수 있었다. LMLA가 약물 전달체임을 증명하기 위해 다양한 pH 조건하에서 약물 방출 거동을 확인한 결과 중성 pH 7.4에서 보다 산성 조건인 pH 5.5에서 더 많은 양의 약물이 방출 됨을 확인하였다. 또한, 정상세포에서 LMLA의 세포 독성을 확인한 결과 세포 생존율이 70% 이상임을 확인 함으로써 생체에도 안전한 물질임을 확인하였다. 또한, 방광암 T24 암세포에서 LMLAF의 항암효과를 확인한 결과 농도가 증가함에 따라 적은 약물로 높은 항암 활성을 확인하였다. 이러한 Part I 결과를 통해 제조된 LMLA는 효율적으로 항암 효과를 가지고 있는 FA를 방광암 세포에 전달하여 높은 항암 효과를 기대할 수 있는 우수한 약물 전달체로써의 가능성을 입증할 수 있었다.
Part II에서는 천연고분자 히알루론산 (HA)을 이용하여 특정 암세포를 표적함과 동시에 방광암세포를 치료할 수 있는 reduction-sensitive 항암제재를 개발하여 그 효과를 평가 하고자 하였다. 특정 암세포를 표적하는 HA에 소수성 물질인 FA와 disulfide 결합 (-S-S-)이 존재하는 cystamine (Cys)을 화학적 반응으로 HA-Cys-FA (HCF)를 합성하였다. 합성된 HCF는 특정 암세포에 존재하는 CD44 수용체에 결합이 가능 할 뿐만 아니라 세포질에 존재하는 glutathione (GSH)에 의해 disulfide 결합이 분해되어 빠르게 약물을 방출 할 수 있어 단 시간에 암세포를 억제할 수 있다는 장점을 갖고 있다. HCF 합성 유무는 ¹H-NMR과 FT-IR을 이용하여 확인 하였으며, 그 결과 모든 특성 피크들을 확인 함으로써 성공적으로 합성이 되었음을 확인 하였다. 항암제인 doxorubicin (DOX)가 담지된 HCF (HCFD) 나노 입자는 투석법에 의해 제조 하였으며, HCF와 HCFD의 입자 구조는 구의 형태를 확인하였고, 입자 크기는 270 ~ 350 nm의 단 분산 형태를 이루는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, HCF가 GSH에 의한 reduction-sensitive 효과를 입증하기 위해 다양한 GSH 농도 조건하에서 시간에 변화에 따른 입자 크기를 관찰한 결과 GSH에 의해 입자 크기가 증가 되는 것을 확인하였고, GSH 유무에 따른 약물 방출 거동을 확인 한 결과에서 GSH를 처리하였을 시 빠른 시간 내에 약물이 과다 방출 됨을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 HCF는 reduction-sensitive 약물 전달체임을 입증할 수 있었다. 또한, 정상세포에서 HCF의 세포 독성을 확인한 결과 세포 생존율이 70% 이상임을 확인 함으로써 생체 내에서 안전한 물질임을 확인 할 수 있었다. DOX가 담지된 HCFD 나노 입자의 항암 활성을 확인한 결과로부터 CD44 수용체가 과다 발현된 HCT116 암세포와 FA에 의한 T24 암세포에서 매우 우수한 항암 효과를 나타낸다는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 HCFD 나노 입자의 효과를 더 입증하기 위해 공초점 현미경 및 유세포 분석기를 통해 확인한 결과 HCT116 암세포에서 DOX의 red 형광이 세포질 및 핵 부분에 많이 존재 함을 확인 함으로써 HCFD 나노입자가 세포에 잘 유입 되는 것을 확인 하였다. 이러한 part II의 결과를 통해 합성된 HCF가 특정 암세포를 표적함과 동시에 DOX 약물을 reduction-sensitive 효과에 의해 빠르게 방출 함으로써 효과적으로 암세포를 사멸 할 수 있는 우수한 약물 전달체임을 확인 할 수 있었다.
Part III에서는 포도 과피 추출물인 천연고분자 anthocyanin을 통해 안구건조증 (dry eye disease, DED)의 개선을 규명하고자 하였다. 추출물인 당 구조를 가진 anthocyanin을 정제 및 여과를 통해 얻었다. 또한, Viscozyme L 효소를 통해 제조된 anthocyanin oligosaccharide는 용매증발법과 한외 여과막을 이용하여 중합하였다. 발효 배양 공정에서 중합 반응이 일어나는 것을 확인하였다. anthocyanin의 화학적 구조 분석과 중합 유무는 ¹H-NMR 및 FT-IR을 이용하여 확인하였으며, 그 결과 anthocyanin monomer와 anthocyanin oligosaccharide의 모든 특성 피크를 확인하였고 NMR peak의 적분 값과 FT-IR 결과값의 대한 Peak 면적 등을 확인하여 anthocyanin의 화학적 구조를 확인하였으며 중합이 잘 되었음을 확인하였다. anthocyanin과 효소 중합된 anthocyanin oligosaccharide의 중량 평균 분자량(Mw)은 약 270 ~ 2200 정도로 확인하였으며, anthocyanin oligosaccharide가 anthocyanin monomer보다 약 7배의 높은 분자량 값을 확인 할 수 있었다. 또한, HPLC를 이용하여 anthocyanin monomer 및 anthocyanin oligosaccharide의 peak area값을 이용하여 정량 분석을 통해 중합 여부를 확인하였고, 레오미터를 통해 시간적 변화와 용액내에서 농도에 의한 파라미터 값을 전단 속도를 통해 점도를 확인 하였으며, 그 결과 anthocyanin oligosaccharide가 약 4배 정도의 높은 점도 값을 보였다. 또한, anthocyanin oligosaccharide의 안구건조증의 개선 효과를 확인하기 위해 임상 유효성 평가를 수행하였고, 그 결과 유효성 평가에서 anthocyanin oligosaccharide 섭취군과 대조군을 비교 하였을 때 섭취한 군에서 쉬르마 I 검사와 눈물 막 파괴 시간는 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 part III의 결과를 통해 포도 과피에서 추출된 anthocyanin의 효소 중합된 anthocyanin oligosaccharide가 안구건조증 개선의 우수한 효과를 가진 것을 입증 할 수 있었다.
Part I ~ III의 연구 내용을 통해 천연 고분자인 저분자량 수용성 키토산과 히알루론산 그리고 anthocyanin oligosaccharide을 경구투여 및 i.v injection등 다양한 약물 전달을 통해 응용할 수 있으며, 천연고분자에 치료의 목적에 맞게 다양한 기능성을 도입한다면 다양한 질병을 치료할 수 있는 약물에 개발에도 적용이 가능할 뿐만 아니라 관련 분야에 많은 응용이 가능할 것으로 사료된다.