표제지
목차
제1장 서론 12
제2장 실험 방법 17
2.1. 세포 배양 17
2.2. Injection-Molded Chip (I-M Chip) 제작 18
2.3. 세포 생존율 분석 및 이미징 22
1) Control 배양 조건에서의 세포 생존율 계산 22
2) 신독성 약물 처리 시 세포 생존율 계산 23
2.4. 면역 형광 염색 (Immunofluorescence) 24
2.5. 포도당 재흡수 25
2.6. TEER 측정 26
2.7. 형광 Permeability 28
2.8. HPLC를 통한 PK 평가 30
2.9. Transporter qPCR 34
2.10. 신독성 약물 처리 36
2.11. 신독성으로 인한 손상 마커 평가 38
제3장 결과 및 고찰 40
3.1. 세포 배양 확인 40
3.2. Static/Fluidic에서의 세포 성장 비교 43
3.3. Metformin을 이용한 PK test 46
3.4. qPCR을 통한 Transporter 발현 확인 48
3.5. 약독성 유발 후 신손상 평가 51
1) 세포 상태 및 손상 지표 확인 51
2) 형광 강도 분석을 통한 세포 생존율의 정량적 분석 53
3) 신손상 지표 KIM-1, NGAL ELISA 및 세포 손상 평가 55
제4장 결론 59
참고문헌 61
약어 65
연구실적 66
국문 초록 68
영문 초록 70
표 1. Transporter 유전자에 대한 Primer 서열 35
그림 1. 사출 성형 Chip 회로도 및 실제 사진. (a) I-M Chip의 전체 구성도. Glass 위에 Polycarbonate를 양면테이프를 이용하여 붙이고 Insert 구멍에 O-ring을 끼운 후 미... 19
그림 2. I-M Chip에 HUVEC 및 RPTEC seeding 방법 개략도. (a) Insert를 상하가 반대가 되도록 뒤집어서 Membrane 위쪽에 collagen type I 을 코팅한 뒤 HUVEC을... 21
그림 3. 실시간으로 측정 가능한 TEER 장비. 전류 측정 가능한 2개의 stick으로 구성 되어 있으며, 긴 쪽의 stick을 Insert 바깥의 Chamber에 짧은 쪽 stick을 Insert 안에 두... 27
그림 4. 근위 세뇨관에서 존재하는 Transporter에 의해 작용하는 분비 이동 과정. OCT2에 의해 Metformin의 분비가 일어나며 Cimetidine을 처리할 경우 OCT2의 활성을... 31
그림 5. HPLC 구성 및 개략도. Insert에서 채취한 배지를 Injector에 20 ul 적용 시킨 후 Detector를 통해 data를 분석. Adapted from Czaplicki, S. Column Chromatogr. 99-... 33
그림 6. MTT를 이용한 독성 약물 농도에 따른 Cell Viability 확인. (R: RPTEC, H: HUVEC, G: Gentamicin, C: Cisplatin, 농도 단위: μM) 37
그림 7. 공초점 현미경을 사용하여 Membrane 기공 사이즈에 따른 TW와 I-M Chip에서 RPTEC의 L&D 이미지 (4X, 20X)와 Immunofluorescence 이미지 (40X) 관찰. L&D... 41
그림 8. 공초점 현미경을 사용하여 Membrane 기공 사이즈에 따른 TW와 I-M Chip에서 HUVEC의 L&D 이미지 (20X)와 Immunofluorescence 이미지 (40X) 관찰. L&D Scale... 42
그림 9. Membrane 크기 (0.4 μm, 3 μm)에 따른 세포 성장 확인. (a) L&D로 촬영한 이미지의 Image J를 통한 세포 생존력 확인. (b) MilliCell ERS-2 Voltohmmeter를 이용... 44
그림 10. TW와 I-M Chip에서 RPTEC와 HUVEC을 14일간 배양한 후 Metformin (100 μM)과 Cimetidine (0.5mM)를 처리하여 6, 12, 24, 48시간 후에 Metformin 분비 농도를... 47
그림 11. Quantitative PCR (qPCR) 발현량 비교 결과 분석. Relative expression levels of OCT2, MATE1. MATE2K, OCTN1. 전체적으로 Transwell보다 Chip에서의 더 높은 Gene... 49
그림 12. 독성 약물을 24시간 동안 처리한 후 공초첨 현미경을 이용하여 촬영한 Cell Live & Dead 및 약독성 마커 KIM-1 (yellow), NGAL (yellow)의 Immunofluorescence... 52
그림 13. 공초첨 현미경을 이용하여 촬영한 형광 이미지를 Image J를 통해 형광 강도 측정. Cell Viability (a)와 KIM-1 (b), NGAL (c)의 형광 강도를 정량화 한 그래프. 약독... 54
그림 14. ELISA를 이용한 약독성 손상 지표인 (a) KIM-1과 (b) NGAL의 농도. 신독성 유발 시 Transwell과 Chip 모두에서 KIM-1과 NGAL의 농도가 증가함. 56
그림 15. 신독성 약물 처리 후 진행한 약독성 평가. Gentamicin을 처리했을 때 (a) TEER, (b) Glucose reabsorption, (c) Permeability를 측정하여 세포 손상이 발생했음을 확인. 57
그림 16. 신독성 약물 처리 후 진행한 약독성 평가. Cisplatin을 처리했을 때 (a) TEER, (b) Glucose reabsorption, (c) Permeability를 측정하여 세포 손상이 발생했음을 확인 58
식 1. [제목없음] 22
식 2. [제목없음] 23
식 3. [제목없음] 25
식 4. [제목없음] 26
식 5. [제목없음] 29