본 연구에서는 흰 쥐의 혈장에서 COVID-19 치료제 후보물질인 CNC1049에 대한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS)을 개발하고 검증하였다. 흰 쥐의 혈장 중 CNC1049를 분석하기 위해 아세토나이트릴을 사용한 단백질 침전법을 통해 시료를 전처리 하였다. 흰 쥐의 혈장 중 CNC1049의 정량을 위하여 이동상은 10mM Ammonium formate in DW와 아세토나이트릴의 조합으로, 분석용 컬럼은 역상으로서 페닐 컬럼을 이용하여 isocratic 용리방식으로 크로마토그램을 확인하였다. CNC1049 및 ibuprofen의 이온의 검출은 ESI negative MRM 모드로 진행하였고, CNC1049는 m/z 324.92 → 170.90 에서, ibuprofen은 m/z 205.06 → 161.10에서 두 채널을 동시에 정량 하였다. 혈장 중 CNC1049의 정량범위는 1 ~ 3,000 ng/mL 이었고, 양호한 직선성을 나타내었다. (r²〉0.99). 해당 분석에서 CNC1049는 0.77분, ibuprofen 은 0.71분의 피크유지시간을 나타내었으며 분석물질이 혈장중 내인성물질과의 간섭없이 일정한 피크유지시간을 나타냄을 확인하였다. 일내, 일간 정밀성(%CV) 및 일내, 일간 정확성(%RE)은 모두 8% 미만으로 확인되었다. 또한 생체시료의 영향, 회수율, 전처리 효율은 77 ~ 96%였다. 시료 취급(3회 냉·해동, 실온에서 6시간, -20℃에서 한달, 전처리 후 24 시간)에 따른 CNC1049의 안정성을 평가한 결과, 상기의 조건에서 99.9%이상의 높은 안정성을 보였다. 개발된 CNC1049의 분석법은 FDA 분석법 및 EMA 가이던스 기준을 충족 하였고, 재현성 있고 신뢰성 있는 분석결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
CNC1049의 체내 동태 연구는 각각 0.3 ~ 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 정맥, 경구 및 근육투여 후 평가되었다. 정맥 투여 후, 반감기, 클리어런스, 분포용적은 대략 각각 1h, 1,000 mL/h/kg, 300 mL/kg로 용량에 상관없이 일정한 값을 나타내었다. 경구 투여 후, 생체 이용률은 5.5%로 추정되었고 체내 약물의 노출은 매우 낮았다. 근육 주사 후, 생체 이용률은 65%로 경구 투여군에 비해 비교적 높은 값을 나타내었다. 흰 쥐에서 CNC1049 300 mg/kg로 경구 투여 후 조직분포실험의 경우, 14 개의 조직 (뇌, 간, 신장, 비장, 위장, 소장, 대장, 고환, 지방, 폐, 심장, 부신, 피부 및 근육)에서 CNC1049는 소화관을 제외하면 주로 부신과 신장에 높게 분포하였다. CNC1049의 배설연구는 흰 쥐에 3 mg/kg로 정맥투여하거나 10 mg/kg로 경구투여 함으로써 진행되었으며, 소변과 대변을 통한 CNC1049의 회수율은 6 % 미만이었다.
한편 in vitro 연구에서 CNC1049가 흰 쥐의 간 마이크로솜에서 반감기가 30분 이내로 불안정했으나, 1상대사가 주요 대사경로가 아님이 예측되었다. CYP 효소 주요 5종(1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4) 중 CYP2C9을 약하게 저해했으며, 마우스, 흰 쥐, 개, 원숭이, 사람의 혈장에서 99.8% 이상의 높은 혈장단백결합률을 보였고 종 간 차이는 없는 것으로 확인되었다.
결론적으로, HPLC-MS/MS를 이용하여 흰 쥐의 혈장에서 CNC1049를 정량하는 분석법을 개발 및 검증하였고, 이 분석법은 흰 쥐에서의 약물동태 연구에 잘 적용되었다.