표제지
목차
List of Abbreviations 9
I. 서론 10
II. 재료 및 방법 14
2.1. 세포 배양 14
2.2. 레트로바이러스 생산 14
2.3. 바이러스 physical titer 측정 15
2.4. 단일 세포 선별 16
(1) 1차 구축 16
(2) 2차 구축 17
2.5. 염색체 내 바이러스 벡터 integrity 확인 18
2.6. 마이코플라즈마 부정 시험 19
2.7. 바이러스 생산 세포주 (VPC)를 이용한 레트로바이러스 생산 20
2.8. 바이러스 biological titer 측정 20
2.9. 전구약물에 의한 세포의 약물 감수성 평가 22
2.10. spRRV 바이러스 벡터 게놈 (genome) 안정성 평가 22
2.11. 통계학적 분석 23
III. 결과 24
3.1. 레트로바이러스 생산 24
3.2. PG13 세포주 기반 spRRVe-sEF1α-TK RV 또는 sRRVgp-sEF1α-yCD8 RV생산 VPCs 1차 구축 28
3.3. 레트로바이러스 벡터의 integrity와 약물 감수성 평가 32
3.4. PG13 세포주 기반 spRRVe-sEF1α-TK RV 또는 sRRVgp-sEF1α-yCD8 RV생산 VPCs 2차 구축 36
3.5. 2차 구축 바이러스 생산 세포주 밸리데이션 40
3.6. env-TK RV와 gagpol-yCD8 RV의 생산성과 감염 효율 평가 48
IV. 결론 및 고찰 51
V. 참고문헌 56
ABSTRACT 60
Table 1. RT-qPCR condition 16
Table 2. PCR conditions and the sequence of primers for amplification 18
Table 3. qPCR condition and the sequence of primers and FAM probe 21
Fig. 1. Metabolic pathway of ganciclovir (GCV) and 5-fluorocytosine (5-FC). 12
Fig. 2. Structure of the spRRVe-sEF1α-TK and sRRVgp-sEF1α-yCD8 vectors. 26
Fig. 3. Optimization of cell line for virus production. 27
Fig. 4. Primary establishment of PG13-based VPCs producing spRRVe-sEF1α-TK RV or... 29
Fig. 5. Screening of primary VPC clones. 30
Fig. 6. Titration of retroviral vectors produced in clonally selected PG13-based VPCs. 31
Fig. 7. Amplification of integrated RRV genome in PG13 and U-87MG chromosome by PCR. 34
Fig. 8. Cytotoxicity in human glioma cells transduced with spRRV-sEF1α-TK and sRRVgp-sEF1α-yCD8 upon... 35
Fig. 9. Secondary establishment of PG13-based VPCs producing spRRVe-sEF1α-TK RV... 38
Fig. 10. Screening of secondary VPC clones. 39
Fig. 11. The integrity of retroviral vector in a chromosome. 43
Fig. 12. Measurement of proviral vector DNA copy numbers in VPCs. 44
Fig. 13. PCR gel electrophoresis results for detection of mycoplasma contamination. 45
Fig. 14. Cytotoxicity in human glioma cells transduced with spRRV-sEF1α-TK and sRRVgp-sEF1α-yCD8 upon... 46
Fig. 15. Stability of RV genomes over multiple serial infections. 47
Fig. 16. Productivities and transduction efficiencies of env-TK RV and gagpol-yCD8 RV. 50