Cathepsin K는 파골세포(Osteoclast)에서 발현되는 enzyme protein으로서 elastin, collagen, gelatin과 같은 뼈의 기질을 이루는 요소들을 분해시켜 골다공증(Osteoporosis)를 유발한다. 따라서 Cathepsin K 억제제 개발은 골다공증의 치료적 접근법을 제시 할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 항체 개발을 위한 전 단계로 Cathepsin K 항원을 얻기 위하여 여러 형식 Cathepsin K gene 클로닝을 진행하였다. 경제적인 면에서 효율적으로 Cathepsin K 항원을 얻기 위하여 mammallian cell이 아닌 E.coli에서 BL21-DE3를 cell line으로 하여 test를 진행하였다. E.coli에서 대량으로 키운 후 cell sonication을 진행하여 Supernatant와 Pellet중 어느곳에서 발현이 많이 되는지 확인하였다. 그 결과 Pellet에서 발현이 되는 Inclusion body 로 확인되었다. Urea를 첨가하여 Inclusion body 를 분리하기 위하여 정제를 진행한 후 다시 urea를 제거해주는 Refolding을 진행하였는데 이 과정에서 단백질이 denaturation된 것인지 컬럼에 Elution 하지 않았다. 이후 mammallian cell인 HEK 293Ecell에 transfection을 진행하였고 western blot을 통하여 발현량을 확인한 결과, 원하는 발현량을 얻을 수 없었다. Cysteine protease인 cathepsin K가 cell에 toxic하여 발현량이 낮은 것은 아닌지 추측하였기 때문에cathepsin K의 가수분해를 활성화 나타내는데 중요한 역할을 하는 아미노산 3개(Cysteine, Histidine, Asparagine)를 Alanine 으로 point mutation을 진행하였다. 이 3가지 아미노산 중 cysteine을 alanine으로 point mutation 시킨 것만 발현량이 증가한 것으로 보아 추측이 옳았음을 알 수 있었다. 발현된 단백질을 세포 바깥으로 분비하도록 하는 체계를 만들고자 1번부터 200번까지의 Signal Peptide Screening을 진행하였다. 그 결과 Signal Peptide 135번에서 발현량이 가장 우수하였고 이에 대한 catehpsin K 항원을 얻기 위하여 Ni-NTA Affinity Chromatography를 진행하였다. 그러나 미세한 양의 단백질이 발현되었고 깔끔하게 분리, 정제 되지않았다. 이에 대한 추측으로 단백질이 His-tag에 binding 하지 않는 것인지 생각하여 단백질을 Flexible하게 만들어주는 G4S Linker를 target gene과 His-tag 사이에 제작하였다. 위와 동일하게 Signal Peptide 1번부터 200까지에 대한 클로닝을 진행한 뒤 항원을 얻기 위하여 Ni-NTA Affinity Chromatography를 진행하였다. 그 결과 G4S Linker를 부착하기 전에 비하여 발현량이 개선된 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 E.coli에서 항원을 얻기는 힘들었고 mammallian cell을 배양하여 Cathepsin K 항원을 얻을 수 있었다.