본 연구는 흑염소 육질과 골의 이화학적 특성을 조사한 후 흑염소 골 열수 추출물을 주성분으로 하여 유용식용소재, 생약재, 간 기능 개선 기능성 소재 등을 활용한 흑염소 골 복합조성물을 개발하여 항산화 효과와 간 기능 개선활성을 조사하였다.
흑염소 육은 수분 75.3%, 조단백질 20.0%, 조지방 3.5%, 조회분 1.2%로 구성되어 있었고, 흑염소 육골즙은 수분 90.5%, 조단백질 8.9%, 조지방 0.2%, 조회분 0.4%로 나타났다. 흑염소 육의 무기질은 K가 487.3mg%로 가장 높았고, P〉 Na〉 Ca〉 Zn〉 Fe〉 Cu 순으로 높게 검출된 반면에 흑염소 육골즙의 무기질은 칼슘과 인이 2,543.7mg%와 2,602.4mg%로서 가장 높았다. 흑염소 육의 아미노산은 glutamic acid가 3,428.1mg%로서 가장 높았고, 필수 아미노산인 lysine, leucine, cysteine, methionine 등이 높게 검출되었다. 흑염소 육골즙의 아미노산 조성은 glycine이 가장 높았고, 그 외에 glutamic acid, alanine, arginine, lysine 등이 주요 아미노산임이 밝혀졌다. 흑염소 육의 지방산 조성은 포화지방산이 47.17%, 불포화 지방산이 52.83%로서 불포화지방산 함량이 높았고, 주요 지방산은 oleic acid(47.45%)〉 palmitic acid(25.14%)〉 stearic acid(16.25%) 순으로 높게 나타났다.
본 연구에서는 in vitro, in vivo 실험을 통해 흑염소 골 복합조성물의 항산화 효과와 동물실험을 통한 부종억제, 세균 감염시 내독소로 작용하는 LPS에 대한 흑염소 골 복합조성물의 항염효과를 확인하고 그 항염효과에 대한 생리작용과 그 작용기작을 연구하였다. Superoxide는 세포구성 성분들인 고분자에 비특이적 파괴작용을 함으로써 노화를 비롯한 여러 염증성 질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. Superoxide 에 대한 흑염소 골 복합조성물의 DNA 보호와 항산화 효과를 SSB SOD, ROS, 지질 과산화를 통해 흑염소 골 복합조성물의 우수한 항산화 효과를 갖는 것을 확인하였다. 또한 내독소에 의한 염증반응과 관계가 있는 NO 및 염증성 cytokines의 생성과 이들 유전자(iNOS, IL-1β, IL-6, TNFα)발현에 대한 영향과 iNOS와 함께 항염제의 주 타겟이 되고 있는 COX-2에 대한 영향을 조사한 결과 Cox-2의 promoter 부위의 AP-1 의 활성이 흑염소 골 복합조성물에 의해 저해되어 AP-1 의 유전자 결합이 감소하여 COX-2유전자의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 유전자 발현의 감소로 PGE₂의 생성이 저해되고, 염증반응에 관련된 염증성 cytokine의 발현 및 기타 염증반응이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 in vitro상의 실험 결과가 실험동물의 부종실험에서도 같은 결과를 나타내는지 Air pouch 방법을 이용한 부종억제 실험을 수행한 결과 pouch 조직 내의 COX-2이 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 염증으로 인해 두꺼워진 pouch의 표피 조직이 흑염소 골 복합조성물에 의해 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 염증에 의해 유발된 농의 량이 흑염소 골 복합조성물에 의해 급속히 감소하였으며, 염증유발 인자인 TNF-alpha와 PGE-2의 생성이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
이러한 결과로 미루어 흑염소 골 복합조성물은 높은 항산화 효과로 유전자의 손상을 저해 하며, 염증성 인자의 promoter 부위의 AP-1 의 활성을 저해 하여 염증반응을 줄이고, 이러한 결과가 동물을 이용한 실험에서도 동일하게 이루어짐을 알 수 있었다.
일차 간세포를 이용한 세포독성 효능을 검색하였는데, 일차 간세포를 이용한 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C의 독성 테스트를 통한 세포독성 유무를 확인하였다.
급성 간독성 동물 모델 확립 및 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C의 효능 연구결과, 급성 간독성 유발물질을 이용한 급성 간독성 모델을 확립하고 APAP에 의한 급성 간독성으로 증가된 혈중 ALT 및 AST 효소 활성변화가 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C에 의해 감소함을 확인하였다.
간 조직을 이용한 지질과산화 및 Glutathione(GSH)의 함량 변화에 대한 연구에서 급성 간독성이 유발된 간 조직을 이용한 지질과산화에서 APAP에 의해 증가된 과산화지질이 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C에 의해 감소함을 확인하였고, 또한 간 조직을 이용한 Glutathione(GSH) 함량 변화에서도 APAP에 의해 소실된 GSH의 함량이 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C에 의해 증가함을 확인하였다.
조직학적인 소견 결과, Haematoxylin Eosin(HE) 염색을 통한 간 조직의 임상학적인 변화에서 APAP에 의해 괴사된 조직이 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C에 의해 보호되는 것을 확인하였다.
약물대사효소의 활성을 측정했을 때, 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C를 단독으로 투여한 경우 APAP와 같은 간 손상을 유발하는 화학물질의 대사에 관여된 간의 약물대사 효소인 Cytochrome(CYP) P450의 효소들 (P405 1A1, P450 2E1)의 활성을 억제하는 것을 확인하였다.
제조 항체를 이용한 Cytochrome(CYP) P450 2E1의 western blotting 실험에서, 마우스를 이용하여 제조한 특이 CYP 2E1의 항체를 이용하여 western blotting을 수행한 결과, 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C 투여 농도 별로 CYP 2E1의 발현이 감소하는 것을 실험동물의 간을 이용하여 확인하였다.
간 성상세포(Hepatic Stellate Cell)의 간 성상세포 증식 억제에 대한 연구에서, 간 성상세포의 배양조건을 확립하고, 간 성상세포를 이용한 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C의 독성 테스트를 통한 세포독성 유무를 확인하였다.
간 성상세포(Hepatic Stellate Cell)를 이용한 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C의 효능 실험에서 간 성상세포의 활성 지표인 alpha-smooth muscle actin(α-SMA) 생성에 대해 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C의 억제 효능을 확인하였다.
간 섬유화 유발물질을 이용하여 간 섬유화 모델을 확립하고 DMN에 의한 간 손상으로 증가된 혈중 ALT 및 AST의 효소 활성변화가 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C에 의해 감소한 것을 확인하였다.
간 섬유화에 의해 증가된 간 조직내 콜라겐의 형성이 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C 투여 농도에 비례하여 간 조직 내 alpha-smooth muscle actin(α-SMA) 의 발현 및 콜라겐 생성 양이 흑염소 골 복합조성물 KBGC-C에 의해 감소하는 것을 확인하였다.